论文部分内容阅读
【研究背景】结肠癌（Colorectal cancer,CRC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率居全球恶性肿瘤第三位,死亡率位于肺癌之后居第二位。CRC早期诊断率低,大多数患者在临床确诊时已有癌转移,其5年生存率仅不足20%,预后极差。目前,中晚期CRC采用化疗、分子靶向治疗和免疫治疗等方法,但多种治疗方式对于晚期CRC存活率的改善十分有限。化疗在CRC的治疗中具有极其重要的地位。因此,探索提高化疗疗效的策略对于提高CRC的治疗效果至关重要。细胞衰老是由多种刺激诱导的不可逆的细胞周期停滞的过程。在肿瘤治疗中的应激治疗诱导性早衰（Therapy-induced senescence,TIS）能产生大量的衰老细胞（Senescent cells,Sn Cs）。尽管它们复制停滞,无法增殖,但它们代谢活跃,可以通过衰老细胞分泌表型（Senescence-associated secretory phenotype,SASP）影响周围细胞。但Sn Cs与CRC发生发展的关系尚不明确。我们的前期预实验发现,接受过化疗的CRC患者的肿瘤组织中衰老标志物高表达,并且表达越高患者预后越差。那么,Sn Cs是否是促进CRC恶性进展的媒介细胞呢?干预或清除Sn Cs的药物是否能增强化疗疗效,抑制CRC恶性进展?深入探讨上述问题,将为以Sn Cs为靶点的肿瘤治疗策略提供理论依据,且明确清除Sn Cs以增强治疗效果的可行性。综上,我们提出假说:化疗诱导了CRC细胞衰老,而结肠肿瘤微环境中的Sn Cs促进了CRC发生发展。通过清除Sn Cs可以抑制CRC恶性进展,同时改善并增强化疗疗效。【研究目的】通过一线基因毒性化疗药构建CRC衰老细胞模型（CRC-Sn Cs）及动物荷瘤模型,并明确CRC-Sn Cs在肿瘤微环境中发挥的作用,同时选取Sn Cs清除药物,联合化疗探讨对结肠癌的疗效,为CRC治疗提供新的研究思路和策略。【研究方法】1.通过免疫组织化学和流式细胞术检测CRC患者组织芯片及患者组织样本中衰老标志物的表达,从而分析接受化疗与未接受化疗的CRC患者的肿瘤细胞衰老的情况及其与患者预后关系;通过冰冻切片免疫荧光、组织SA-β-gal染色及Western blotting验证化疗导致荷瘤小鼠肿瘤细胞衰老及Sn Cs与化疗效果的相关性。2.在细胞水平,使用化疗药物伊立替康（Irinotecan,IRI）诱导HCT-116细胞衰老,通过SA-β-gal染色、流式细胞术及免疫荧光鉴定HCT-116结肠癌衰老细胞（CRC-Sn Cs）,同时通过q RT-PCR鉴定CRC-Sn Cs常见SASP的表达情况;收集CRC-Sn Cs分泌上清进行蛋白质谱检测及生物信息学分析。3.通过Transwell实验及激光全息细胞成像观察共培养的CRC-Sn Cs对CRC细胞侵袭及运动能力的影响;通过小管形成实验检测CRC-Sn Cs对HUVEC体外小管形成能力的影响;动物水平使用CRC-Sn Cs分泌上清混合CRC接种小鼠皮下构建荷瘤模型,检测衰老肿瘤细胞在体内对CRC细胞的影响。4.通过CCK-8筛选衰老细胞清除药物;通过荧光及流式细胞术检测凋亡标志物从而鉴定衰老细胞清除药物对Sn Cs的杀伤作用;通过对小鼠荷瘤模型的治疗,在动物水平验证化疗联合衰老细胞清除药物对CRC生长的影响。5.通过Western blotting验证化疗联合衰老细胞清除药物的分子机制。【研究结果】1.接受化疗的CRC患者肿瘤衰老标志物p21表达显著高于未化疗患者,其中p21高表达的患者生存期更短;化疗导致小鼠荷瘤中衰老标志物SA-β-gal及p21表达增加,且p21表达与瘤重呈正相关。2.低剂量IRI多次给药导致结肠癌细胞SA-β-gal、p21等衰老标志物高表达,SASP分泌因子表达量增加;CRC-Sn Cs分泌上清的蛋白质谱检测显示,分泌上清中的差异蛋白主要富集在细胞活力、细胞运动以及血管形成等通路中。3.共培养CRC-Sn Cs促使CRC细胞的侵袭及运动能力增强;在CRC-Sn Cs上清中培养的HUVEC细胞小管形成数量增多;混合CRC-Sn Cs上清接种的CRC细胞在小鼠皮下成瘤更快、组织中CD31及MMP3表达升高。4.衰老细胞清除药物Navitoclax对CRC-Sn Cs杀伤效果明显,联合二甲双胍（Metformin）杀伤CRC-Sn Cs作用更明显,并促进细胞凋亡;在体内,IRI联用Navitoclax+Metformin显著抑制肿瘤生长;Navitoclax+Metformin可显著清除小鼠肿瘤微环境中的CRC-Sn Cs。5.Western blotting显示CRC-Sn Cs中抗凋亡蛋白Bcl-2高表达,Navitoclax通过拮抗Bcl-2增加Bim的表达量,Metformin抑制CRC-Sn Cs中Bcl-2的过表达,二者联用增强Bax的作用,促进细胞色素C的释放,从而增强caspase-3的切割,最后导致衰老细胞凋亡。【结论】1.化疗导致CRC患者产生衰老肿瘤细胞,化疗诱导的衰老肿瘤细胞与CRC患者预后呈负相关;化疗导致荷瘤小鼠产生衰老肿瘤细胞,衰老肿瘤细胞与荷瘤小鼠治疗效果呈负相关。2.通过IRI诱导CRC细胞衰老,建立结肠癌衰老细胞模型（CRC-Sn Cs）。分泌上清蛋白质谱提示CRC-Sn Cs可能通过SASP分泌因子影响肿瘤细胞的活力、迁移及血管形成。3.CRC-Sn Cs促进结肠癌侵袭、运动能力及HUVEC小管形成,其分泌上清在体内促进CRC的成瘤与生长,并影响肿瘤微环境中血管形成,提升CRC的侵袭能力。4.衰老细胞清除药物Navitoclax+Metformin对CRC-Sn Cs具有杀伤作用;体内化疗联用衰老细胞清除药物能有效清除CRC-Sn Cs,抑制CRC的恶性进展。5.Navitoclax+Metformin通过降低CRC-Sn Cs中的抗凋亡蛋白的表达和相互作用、增强促凋亡蛋白的功能,诱导CRC-Sn Cs凋亡。