核糖核酸酶（RNase）普遍存在于生物体内,参与DNA复制、转录、RNA的剪切及循环利用等多种生物学过程。依据RNase经2’,3’环核苷酸水解RNA为3’单核苷酸的不同,被分为RNase A、RNase T1和RNase T2家族。RNase A和RNase T1属于碱性RNase,分别特异性水解嘧啶核苷酸和鸟苷酸,而RNase T2为酸性RNase,无碱基特异性。其中,部分核糖核酸酶属于分泌型蛋白,独立于胞内RNA加工,参与一系列的细胞学过程。RNase T2家族蛋白通常分泌至胞外或定位于细胞内的溶酶体或液泡,参与多种生物学过程,包括清除核酸、营养利用、氧化胁迫应激反应、细胞免疫、植物自交不亲和、叶片衰老等。一些病毒RNase T2对哺乳动物免疫细胞具有选择性细胞毒性,干扰宿主免疫反应。然而,其它病原菌（细菌、真菌等）分泌型RNase T2是否参与干扰和破坏宿主免疫反应以及侵染致病,尚不明确。真菌核毒素是分泌型的高度特异性核糖核酸酶,主要由丝状真菌产生,与RNase T1家族蛋白类似,能特异裂解鸟苷酸,但它们具有额外的环状结构,具有多种细胞毒性和杀虫活性。破坏球孢白僵菌核毒素基因rib导致菌株毒力显著下降,而过表达rib是否提升菌株毒力值得探讨。课题组在解析研究昆虫病原真菌球孢白僵菌表面蛋白时,发现存在两个分泌型RNase T2蛋白和一个核毒素,分别命名为BbTrv、Bb RNT2及Bbrib,该发现为探究病原真菌分泌型核糖核酸酶与侵染致病的关系提供了线索。本论文以RNase Trv（BbTrv）和Bbrib为研究对象,结合表达分析、基因破坏、过表达及体外表达技术,探究了二者与菌株生长发育及侵染致病的关系。主要研究结果如下:1.BbTrv与Bb RNT2序列结构及系统进化分析通过基因组搜索发现,球孢白僵菌仅存在课题组发现的两个分泌型RNase T2家族蛋白编码基因,BBA＿00766和BBA＿00428。两个蛋白N端均存在典型的信号肽序列,包含T2家族蛋白共有的两个保守氨基酸域（CASⅠand CASⅡ）和三个His功能位点。BBA＿00766编码257个氨基酸,分子量约为27.82 k Da,等电点为4.60,氨基酸序列与绿色木霉菌（Trichoderma viride）的RNase T2蛋白RNase Trv相似性达67.7%,命名为BbTrv。BBA＿00428编码328个氨基酸,分子量约为36.10 k Da,等电点为6.32,氨基酸序列与RNase Trv的相似性仅为26.83%,命名为Bb RNT2。生物信息学分析表明,BbTrv与Bb RNT2均没有典型的核定位信号。BbTrv存在两个假定N-糖基化位点和两个假定的O-糖基化位点,而Bb RNT2分别存在四个预测的N-糖基化位点和七个O-糖基化位点。而且,BbTrv还存在B1和B2核苷酸结合域（B1、B2 nucleotide binding pocket）。系统进化树分析发现,BbTrv与Bb RNT2聚为不同的分支,表明BbTrv与Bb RNT2在进化上属于不同类型的RNase T2蛋白。2.BbTrv和Bbrib表达特性分析利用q RT-PCR和启动子区融合GFP分析表达特性,发现BbTrv和Bbrib均在菌丝形态的表达水平显著高于分生孢子、芽生孢子和虫菌体形态,且受营养饥饿、昆虫血淋巴和氧化胁迫的诱导。由此推测,BbTrv和Bbrib可能参与病原菌营养利用和氧化胁迫反应。3.BbTrv可分泌至胞外基质通过组成型表达融合GFP标签检测BbTrv蛋白分布,发现去除信号肽的BbTrv分布于细胞质,而包含信号肽的融合蛋白,仅在气生菌丝和分生孢子表面观察到荧光,而在液生菌丝、芽生孢子和虫菌体中均未观察到荧光,推测分泌到胞外基质。利用Western blotting（GFP抗体）检测发现,在培养液中存在63 k Da的融合蛋白与分子量为40 k Da的蛋白,推测该蛋白为不同程度降解的融合蛋白。由此表明,BbTrv既可分布在细胞表面,也可分泌到胞外。4.BbTrv具有典型的N-糖基化位点和RNA降解活性利用毕赤酵母成功表达了BbTrv蛋白,SDS-PAGE及Western blotting分析发现,BbTrv分子量约为37 k Da,大于理论分子量27.82 k Da。利用去N-糖基化酶处理后,发现出现1条约30 k Da的蛋白迁移带。该结果表明BbTrv存在预测的N-糖基化修饰。酶活性检测发现,BbTrv具有降解RNA活性,但对单链DNA仅有微弱降解活性,对双链DNA无降解活性。该结果进一步证明了BbTrv具有核糖核酸酶活性。5.过表达BbTrv和Bbrib均影响菌株的生长发育及氧化胁迫反应为探究BbTrv与菌株生长发育的关系,分别获得了基因破坏、回复互补和过表达菌株。结果发现,破坏BbTrv不影响菌株的生长发育,而过表达则显著提高了菌株的生长速率。然而,过表达基因引起产孢结构异常,分生孢子和芽生孢子产量显著下降。进一步检测发现,过表达BbTrv显著下调了产孢相关基因。由此表明,BbTrv参与菌株营养利用,调控产孢相关基因转录,影响产孢。破坏BbTrv对菌株氧化胁迫（H2O2和MND）反应无明显差异,而过表达BbTrv菌株的氧化耐受性显著增强。体外检测发现,BbTrv具有降解H2O2活性。由此表明,BbTrv具有分解活性氧的功能,参与菌株氧化胁迫反应。过表达Bbrib也提高了菌株的生长速率和对氧化胁迫的耐受性,但削弱了产孢能力。6.BbTrv和Bbrib均与菌株侵染致病和逃避宿主血腔免疫反应相关生物测定结果表明,破坏BbTrv不影响菌株毒力,而过表达菌株穿透昆虫体壁显著滞后,毒力降低。然而,将分生孢子微量注射接种后发现,尽管过表达菌株在虫体内的增殖速度明显滞后于野生亲本菌株,但可引起昆虫快速死亡。将酵母表达的重组蛋白与野生菌株共注射后发现,也促进了昆虫快速死亡。血细胞统计发现,接种过表达菌株虫体的血细胞数目显著低于野生菌株感染的虫体,推测BbTrv对昆虫血细胞具有细胞毒性。而且,注射过表达菌株的昆虫酚氧化酶酶活显著降低,活性氧（H2O2）水平显著低于接种野生菌株。将重组蛋白BbTrv注射接种虫体,发现BbTrv引起昆虫血细胞发生明显的凝集反应,血细胞数目显著减少。由此表明,球孢白僵菌分泌的BbTrv对昆虫血细胞具有毒性,抑制宿主免疫反应。将过表达Bbrib菌株的分生孢子微量注射虫体,也导致昆虫快速死亡,并伴随着昆虫酚氧化酶酶活和活性氧（H2O2）水平显著降低。该结果表明,超量表达Bbrib可提高菌株毒力。论文研究结果表明,分泌型T2家族核糖核酸酶BbTrv影响球孢白僵菌产孢,参与氧化胁迫反应,具有血细胞毒性,干扰或破坏昆虫免疫反应,影响毒力。超量表达核毒素基因Bbrib干扰昆虫免疫反应,提高了菌株毒力。