研究背景衰老是生命随时间老化的过程，最终结果是个体的死亡。这一过程表现为结构的退行性变和功能的衰退，对外界的适应性和抵抗力减弱。在人类，常见的衰老征象有皮下脂肪减少，出现皱纹；汗腺、皮脂腺萎缩；黑素细胞增生出现老年斑、记忆衰退、反应迟缓、血管弹性降低等。此外，衰老过程还常常伴有退行性疾病的发生和发展，如阿尔茨海默氏病，肌萎缩性侧索硬化症，帕金森氏病，亨廷顿氏病等。关于衰老发生的原因和机制迄今已提出众多学说，如程序衰老说、DNA修复缺陷说、大分子交联说、免疫机能退化说、神经内分泌说、自由基学说及中医的精气亏损学说等，但都各有局限，无法完全解释衰老过程中发生的种种疾病及现象。虽然目前对衰老过程的认识还不全面，但随着现代分子生物学研究手段的不断更新，越来越多的证据指向了衰老的自由基学说。衰老的自由基学说核心是氧化应激。已有研究证实氧化应激与年龄相关的神经退行性改变，如阿尔茨海默氏病，肌萎缩性侧索硬化症，帕金森氏病，亨廷顿氏病和朊病毒病密切相关。然而，目前还不清楚氧化应激究竟是介导疾病发生的主要致病因素还是由其他神经退行性变主导因素引起的并发现象。究其原因，很大程度上是因为缺少合适的动物模型以支持这些学说的在体实验验证，不能为衰老过程提供足够可靠的证据。线粒体是活性氧自由基的主要来源，已有研究证实线粒体功能障碍会导致神经变性，但缺乏直接的证据表明氧化应激是神经退行性改变的基础。作为细胞能量代谢、凋亡调节、细胞内钙离子稳态维持等细胞功能的重要组织者和生物体内主要的超氧化物生成场所，线粒体正常功能的维持是保证DNA、蛋白质和脂类分子免遭氧化损伤的必要条件。对线粒体基因的突变往往会得到表型上巨大的改变，从而导致转基因动物在胚胎期即死亡，这使对线粒体功能异常在衰老、神经变性及生殖等方面的作用研究几乎不可能在活体动物中进行。线粒体内膜肽酶（Mitochondrial inner membrane peptidase，IMP）是一组信号肽酶复合体，主要功能为识别和水解定位于线粒体膜的膜蛋白携带的信号肽，保证它们在线粒体中正确定位并发挥作用。因此，将小鼠线粒体内膜肽酶类似物IMP2突变后，该基因产物缺失将影响细胞色素C1和磷酸甘油脱氢酶2在线粒体内膜的准确定位，直接导致细胞内活性氧自由基增多，消耗一氧化氮、还原型谷胱甘肽等细胞内抗氧化物，使细胞处于氧化应激状态。这一突变在动物个体水平并不足以致死或导致细胞迅速凋亡，所以Immp2lTg（Tyr）OVE979突变小鼠品系可用于观察线粒体活性氧自由基水平过高在活体水平产生的一系列影响及探讨其病理生理机制。尽管对线粒体活性氧自由基在衰老和年龄相关性病变中所起作用已积累了部分体外研究的证据，但仍缺乏在体证据及具体作用机制的线索。因此设计了第一部分的实验，意在阐明Immp2l突变小鼠线粒体功能、氧自由基产生与细胞内一氧化氮含量、神经损伤病变相关程度，用过量自由基导致氧化应激异常引起衰老的同一机理来解释在Immp2l突变小鼠中观察到的共济失调、肌力异常、驼背等年龄相关性神经系统退行性病变，进一步确认Immp2l突变小鼠作为衰老动物模型的可行性，并为神经退行性病变的发病机制和治疗方法提供新的诊疗依据和思路。此外，对Immp2lTg（Tyr）OVE979突变小鼠的前期研究提示其体内存在高水平的活性氧自由基，且突变小鼠表现出一系列形态和生理异常。观察发现，Immp2l突变小鼠体形小于同年龄性别的野生型且几乎没有皮下脂肪分布，这与衰老过程中软组织老化的表现非常类似。前人研究提示活性氧自由基可能通过调控大脑中的NPY/AgRP及POMC神经元从而影响摄食行为，但其具体机制不明。而已知一氧化氮是一种能作用于多个物种刺激摄食的信号分子。因此在这里猜想活性氧自由基很可能通过与一氧化氮作用而影响了位于下丘脑的摄食中枢，导致了摄食行为异常从而导致小鼠提前出现体重停止增长、脂肪沉积减少等衰老征象。本研究从以上两个方面着手，阐明了Immp2l突变后线粒体氧化应激水平异常是否是动物出现前述异常行为学表现的原因及此过程中的可能机制。研究方法及结果1、实验一，研究Immp2l突变小鼠年龄相关性小脑病变与超氧化物及NO的关系。从Immp2l突变小鼠比野生型小鼠提前发作的共济失调、驼背及牵张反射异常等表现入手，分析小脑组织结构、NO合酶表达、细胞过氧化产物水平及颗粒细胞凋亡情况，并分离培养不同基因型小鼠小脑颗粒细胞，测定线粒体呼吸链与能量代谢水平、超氧化物及cGMP含量等。结果证实突变小鼠小脑颗粒细胞线粒体中超氧化物水平升高， NO合酶表达上调、NO下游信号分子cGMP降低，组织学层面上表现为老年小鼠小脑颗粒细胞凋亡增多，颗粒细胞层变薄，小脑重量减轻，解释了突变小鼠提前发作的共济失调、驼背及牵张反射异常等年龄相关性中枢神经病变表现。2、实验二，研究Immp2l突变小鼠体重下降及皮下脂肪减少是否是食欲降低摄食减少所致。在这一部分中对Immp2l突变小鼠的摄食活动进行了观察和测量，并计算其能量消耗率、皮下脂肪分布状态、下丘脑组织硝酸盐／亚硝酸盐含量、cGMP含量及NO通路相关基因表达水平。证实了Immp2l突变小鼠摄食量低于野生型小鼠，在排除了能量消耗增高、活动量大及激素代谢异常等影响体重及脂肪沉积的因素后，结合下丘脑中硝酸盐／亚硝酸盐含量及cGMP含量下降、NO合酶表达上调的实验结果，可认为活性氧自由基降低了下丘脑组织中的NO生物利用度，从而影响了位于下丘脑的摄食中枢导致摄食量下降。研究意义及创新性本研究利用独特的Immp2lTg（Tyr）OVE979小鼠模型，在排除能量代谢障碍导致中枢神经系统功能异常的前提下，就大量产生的活性氧自由基造成的细胞水平氧化应激在中枢神经系统的表现及其可能作用机制进行了探讨，确立了NO/cGMP通路受损在Immp2lTg（Tyr）OVE979小鼠中枢神经系统功能异常过程中的中心地位，同时，为经典氧化应激学说中关于活性氧自由基产生过多抑或活性氧自由基清除酶减少的争论提供了支持前者的可靠证据。在未来的在体氧化应激机制研究中，Immp2lTg（Tyr）OVE979突变小鼠可作为合适的实验动物模型用于衰老过程的研究。结论1、Immp2l突变在线粒体产生过量氧自由基但并不伴随能量代谢缺陷，因此Immp2lTg（Tyr）OVE979突变小鼠可作为研究氧化应激在活体水平影响与病理机制的良好动物模型。2、Immp2lTg（Tyr）OVE979突变小鼠提早发作的神经退行性病变与小脑颗粒细胞氧化应激损伤相关，这一过程中，大量生成的活性氧自由基产生的氧化应激效应不能被NO合酶上调所抵消，最终表现为提早出现的共济失调等异常表现，证明在氧化应激过程中活性氧自由基产生过多扮演着更重要的角色。3、Immp2lTg（Tyr）OVE979突变小鼠摄食量下降导致了体重减轻和皮下脂肪沉积减少，超氧化物水平增高使摄食中枢NO生物利用度降低是导致摄食减少的重要原因。