鸡传染性贫血病是由鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)引起以再生性障碍贫血和淋巴器官萎缩等为主要特征的免疫抑制病,可导致其他种类疫苗接种失败,造成严重的经济损失。目前,已有多个国家报道了鸡群中存在较高CAV血清抗体阳性率。因而有效监测CAV对防控该病具有重要意义。本研究在前期工作基础上,进一步基于病毒异种蛋白表位肽不同方式的组合,探索能同时检测抗CAV多个病毒抗体的间接ELISA方法,为CAV感染的疫情监控提供参考和依据。首先,进行病毒蛋白表位的预测与组合。CAV病毒基因组共编码3个蛋白(VP1、VP2和VP3),通过DNAStar生物信息学软件分析VP1、VP2和VP3基因及其编码的优势线性表位肽,从中选取了8个表位肽(包含3个VP1、3个VP2及2个VP3抗原表位),通过柔性连接肽(AAY)进行串联,组合方式分别为VP1+VP2+VP3(CAV123)、VP1+VP2(CAV12)、VP2+VP3(CAV23)、VP1+VP3(CAV13)以及恒定链关键活性四肽(Ii-key)与CAV123的组合(Ii-CAV123)。其次,扩增表位肽基因并构建重组质粒和诱导融合蛋白的表达。(1)合成Ii-CAV123表位肽组合基因序列,通过特异性引物以SOE-PCR方法扩增出CAV13基因片段,其他组合则以PCR方法直接获得,并在基因序列两端添加Sal I与Eco R I酶切位点,分别与p ET-32a原核表达载体连接、转化大肠杆菌感受态细胞,经PCR鉴定和测序鉴定基因序列。结果表明,已成功获得了p ET-32a/Ii-CAV123、p ET-32a/CAV123、p ET-32a/CAV12、p ET-32a/CAV23和p ET-32a/CAV13等5种表位肽组合的重组质粒和重组菌。(2)将重组菌分别以IPTG诱导表达利用切胶法纯化蛋白,以SDS-PAGE电泳检测蛋白表达、纯化及表达形式的鉴定。结果表明,融合蛋白r Ii-CAV123(36.8k Da)、r CAV123(36.3k Da)、r CAV23(30.4k Da)、r CAV12(32.6k Da)和r CAV13(30.8k Da)主要以可溶性方式表达,通过抗VP1和VP2多克隆抗体经Western blotting检测显示融合蛋白均具有良好的反应原性。最后,建立间接ELISA检测CAV抗体的方法。(1)分别以融合蛋白为包被抗原,以间接ELISA(i ELISA)方法通过交叉反应试验检测其与ALV-J等特异性血清是否存在交叉反应。结果显示,仅r CAV13蛋白与ALV-J等特异性血清无明显交叉反应,因此选择r CAV13作为包被抗原。(2)为了确定最佳反应条件,本实验以r CAV13蛋白进行4℃包被过夜,优化抗原浓度、显色时间、酶标抗体的孵育时间并筛选封闭液和显色液等。结果显示,抗原为30μg/m L,5%脱脂奶粉37℃封闭1h,待检血清样本于37℃孵育45min,酶标抗体结合40min,TMB显色反应8min等反应条件,建立了i ELISA检测方法(命名为CAV13-i ELISA),该方法检测临界值为0.645,批间变异系数为2.0%-11.7%,具有良好的重复性。(3)利用CAV13-i ELISA方法对临床88份待检血清样本进行检测,以商品化试剂盒检测结果作为参照。结果显示两者的符合率为76.10%,CAV13-i ELISA比试剂盒方法具有更高阳性率(9.09%)。随机抽取差异血清样品,将r CAV13以SDS-PAGE电泳后进行Western blotting验证,结果显示与ELISA检测结果一致。综上所述,本实验设计了5种CAV蛋白表位肽基因的组合方式,筛选出r CAV13组合蛋白作为包被抗原,在优化反应条件基础上建立了CAV13-i ELISA方法,该方法与商品化试剂盒相比具有更高的阳性率,且显示CAV13能够特异性识别临床血清抗体。本研究结果为CAV感染的血清学调查和疫病防控提供检测方法。