卵巢癌是较常见的妇科恶性肿瘤，2011年，卵巢癌死亡率在美国占据第五位。根据美国癌症学会（American Cancer Society，ACS）的流行病学资料统计，2015年美国全年新发卵巢癌病例21290人，占全部新发女性恶性肿瘤的2.6%；死亡病例14180人，占全部肿瘤死亡病人5%。在所有的卵巢恶性肿瘤组织学类型中，80%-90%是上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）。随着医疗技术的进步，在过去50多年中，卵巢癌的诊断方法及治疗手段有了持续的发展，然而，其5年生存率始终低于50%。由于卵巢癌的遗传因素和分子致病机制不明确，且早期患者缺乏特异性症状，因此大部分患者诊断时已是晚期，出现广泛转移，导致预后差。因此，聚焦于肿瘤早期诊断的治疗策略对于卵巢癌患者是极其重要的，但目前卵巢癌发生和发展的生物学机制仍尚未明确。　　SOX基因是哺乳动物Y染色体上的性别决定基因SRY/Sry,它具有一个HMG-box（高迁移率编组框），能够编码转录因子，并通过高度保守序列的HMG-DNA结合域与DNA相互作用。人SOX3基因属于SOXB1亚族，定位于Xq27.1染色体。SOX基因参与调控哺乳动物许多重要的发育过程，包括性别决定、神经发育、性别分化、软骨形成、胸腺细胞分化以及睾丸发育。最近，许多研究发现SOX基因参与肿瘤的发生与发展，例如在乳腺肿瘤、脑肿瘤、胰腺肿瘤以及前列腺肿瘤。2000年，有学者在鸡胚成纤维细胞中证明SOX3的异常表达会造成肿瘤转化，提示SOX3可以诱导细胞异常增生并促进肿瘤发生与发展。此后，在逆转录病毒插入点的基因组分析研究中证实，SOX3是原癌基因，在小鼠基因中逆转录进SOX3后会导致T细胞淋巴瘤。　　本课题拟从三个方面进行研究：　　（1）首先检测不同上皮性卵巢癌细胞株和卵巢癌组织标本中的SOX3表达，并探讨其与各项临床病理参数的相关性，以及与总体生存时间和无瘤生存时间的相对危险度；　　（2）分别通过上调或下调SOX3的表达，检测其对上皮性卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭、粘附、凋亡能力的影响；　　（3）探讨SOX3通过靶向Src激酶促进上皮性卵巢癌细胞转移的相关机制。　　第一部分 SOX3在上皮性卵巢癌中的表达及其临床意义　　1.目的：检测不同上皮性卵巢癌细胞株及卵巢癌组织标本中SOX3的表达，并分析其与临床各项病理参数的关系。　　2.方法：利用qRT-PCR、Western blot以及免疫荧光的方法检测正常卵巢上皮细胞株、交界性卵巢囊腺瘤细胞株、以及不同上皮性卵巢癌细胞株中SOX3 mRNA及蛋白的表达水平；使用免疫组织化学的方法检测卵巢癌组织中SOX3的表达，并应用免疫组化评分法半定量分析SOX3表达与临床病理参数的关系。用Kaplan-Meier生存曲线和对数秩检验（log-rank test）方法评估SOX3表达与上皮性卵巢癌病人总体生存时间和无瘤生存时间之间的相关性；采用logistic多元回归方法分析SOX3表达与上皮性卵巢癌病人总体生存时间和无瘤生存时间的相对危险度。　　3.结果：　　（1）SOX3在人上皮性卵巢癌细胞株中高表达：在人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3、SKOV3-ip、 HO8910、HO8910-pm、ES2，人卵巢交界性囊腺瘤细胞株MCV-152、人卵巢永生化上皮细胞株Moody中检测SOX3 mRNA及蛋白的表达水平。结果显示：SOX3 mRNA在人卵巢癌细胞株中均表达上调。其中，高转移细胞株SKOV3-ip和HO8910-pm中SOX3的表达要显著高于其父辈细胞株SKOV3和HO8910（p<0.01）。ES2中SOX3呈中度表达。而在MCV-152和Moody中SOX3表达较低。与正常卵巢组织及卵巢交界性囊腺瘤相比，SOX3蛋白在不同上皮性卵巢癌细胞株中的表达水平均显著升高。其中，高转移细胞株SKOV3-ip和HO8910-pm中SOX3蛋白表达要显著高于其父辈细胞株SKOV3和HO8910。ES2中SOX3蛋白呈中度表达。而在MCV-152和Moody中SOX3蛋白表达较低，这与SOX3 mRNA表达变化趋势一致。　　（2）组织中表达：在142例上皮性卵巢癌组织、28例交界性卵巢肿瘤组织、33例卵巢囊腺瘤组织、以及25例正常卵巢组织中，正常卵巢组织不表达SOX3；卵巢囊腺瘤组织少部分表达SOX3；交界性卵巢肿瘤组织中SOX3阳性表达比例小于40%；而上皮性卵巢癌组织中SOX3阳性表达比例大于70%。Western blot结果与与免疫组化结果一致：SOX3表达强度从卵巢囊腺瘤组织，交界性卵巢肿瘤组织，到上皮性卵巢癌组织逐步升高。人卵巢组织SOX3主要在细胞核内表达。在142例上皮性卵巢癌组织中有109例(76.8%) SOX3表达阳性；在28例交界性卵巢肿瘤组织中有7例（25%） SOX3表达阳性；在33例卵巢囊腺瘤组织中有3例（9.1%）SOX3表达阳性；所有正常卵巢组织中SOX3表达均为阴性。与正常卵巢组织相比，上皮性卵巢癌组织中SOX3的表达明显增强（P<0.001）；与卵巢囊腺瘤组织相比，上皮性卵巢癌组织中SOX3的表达也具有显著统计学差别（P<0.001）。　　（3）SOX3表达情况与上皮性卵巢癌病理参数相关性：上皮性卵巢癌中SOX3阳性表达与肿瘤分级和FIGO分期显著相关（P值分别为0.018和0.004）。在肿瘤分级G3的卵巢癌病人中，SOX3阳性的比例为85.1%（63/74）。在FIGO II-IV期的卵巢癌病人中，SOX3阳性的比例为81.7%（94/115）。从肿瘤分级G1，G2到G3，SOX3的表达逐渐增加；从FIGOⅠ期到FIGO II-IV期，SOX3的表达逐渐增加。SOX3的表达与年龄、组织学类型、血清CA125水平和腹水量无显著相关性。　　（4）上皮性卵巢癌SOX3表达情况与总体生存时间（OS）和无瘤生存时间（DFS）的相关性：在上皮性卵巢癌中，SOX3表达阳性的患者比SOX3表达阴性的患者总体生存时间短（29.0个月/31.0个月，95%CI：25.1-32.9/21.2-40.7，P=0.029）。SOX3表达阳性的患者比SOX3表达阴性的患者无瘤生存时间短（14.0个月/19.0个月，95%CI：11.5-16.5/11.7-26.3，P=0.002）。SOX3表达阳性的卵巢癌患者比SOX3表达阴性的卵巢癌患者3年和5年生存率更低。多因素非条件logistic回归分析证实：当年龄、组织学类型、肿瘤分级、FIGO分期、血清CA125水平及腹水量等变量变化时，SOX3表达情况是上皮性卵巢癌病人总体生存时间的独立预测因子。SOX3表达阳性的上皮性卵巢癌病人死亡分险更高（odds ratio[OR]4.02，95%CI：1.03-15.71，P=0.045）。然而，SOX3表达阳性与上皮性卵巢癌无瘤生存时间无显著相关性（OR1.57，95%CI，0.35-6.99，P=0.554）。此外，FIGO II-IV期比FIGO I的上皮性卵巢癌病人死亡风险高（OR3.91，95%CI：1.15-13.24，P=0.029），复发风险高（OR4.65，95%CI：1.19-18.25，P=0.027）。　　第二部分 SOX3对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响　　1.目的：探索SOX3对上皮性卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡以及粘附能力的影响。　　2.方法：通过质粒过表达及shRNA干扰改变上皮性卵巢癌细胞中SOX3的表达，应用CCK-8、Transwell小室、克隆形成，流式细胞等功能实验研究SOX3在上皮性卵巢癌细胞株增殖、迁移、侵袭、凋亡和细胞粘附中的作用。　　3.结果：　　（1）转染效果检测：转染SOX3过表达质粒的HO8910细胞中SOX3 mRNA相对表达量增高4.04倍（P<0.01）；SOX3蛋白表达水平同样在SOX3过表达组显著升高。转染shRNA-SOX3干扰质粒的SKOV3及SKOV3-ip细胞中SOX3 mRNA相对表达量分别下调0.23倍及0.15倍（P<0.01）；SOX3蛋白表达水平同样在SOX3抑制表达组显著降低。　　（2）细胞增殖：使用CCK-8增殖实验检测SOX3对上皮性卵巢癌细胞增殖的影响，结果显示，与对照组及转染空质粒组相比，过表达SOX3显著促进上皮性卵巢癌细胞HO8910增殖，增殖率在24小时，48小时，72小时分别为143.55%，152.28%及114.17%（P值＜0.001）。相反，降调SOX3显著抑制上皮性卵巢癌细胞SKOV3增殖，增殖率在24小时，48小时，72小时分别为78.27%，65.00%及82.39%；P值＜0.001；同样，降调SOX3显著抑制上皮性卵巢癌细胞SKOV3-ip的增殖，增殖率在24小时，48小时，72小时分别为65.46%，56.88%及71.71%；P值＜0.001。　　（3）侵袭及迁移：与对照组相比，转染SOX3过表达质粒的HO8910细胞侵袭增加52.9%(P＜0.01)；转染SOX3降调shRNA质粒的SKOV3和SKOV3-ip细胞侵袭分别下降36.2%(P＜0.01)及31.9%(P＜0.01)。转染SOX3过表达质粒的HO8910细胞迁移增加22.7%(P＜0.01)；转染SOX3降调shRNA质粒的SKOV3和SKOV3-ip细胞迁移分别下降22.7%(P＜0.01)及31.2%(P＜0.01)。　　（4）凋亡：与转染对照质粒的细胞及野生型细胞相比，转染SOX3过表达质粒的HO8910细胞中凋亡细胞比例明显下降；转染SOX3降调shRNA质粒的SKOV3和SKOV3-ip细胞中凋亡细胞比例明显上升。　　（5）克隆形成：过表达SOX3促进上皮性卵巢癌细胞克隆形成。HO8910细胞对照组、转染空质粒载体的HO8910细胞组、转染SOX3过表达质粒的HO8910细胞组克隆形成率分别为20.0%、18.30及32.70%（P＜0.001）。相反，降调SOX3的表达使SKOV3细胞及SKOV3-ip细胞形成的克隆数显著减少。SKOV3细胞对照组、转染空质粒载体的SKOV3细胞组、转染SOX3-shRNA质粒的SKOV3细胞组克隆形成率分别为14.70%、13.70%及8.30%（P＜0.001）；SKOV3细胞对照组、转染空质粒载体的SKOV3细胞组、转染SOX3-shRNA质粒的SKOV3细胞组克隆形成率分别为11.30%、12.40%及7.90%（P＜0.001）　　（6）细胞间粘附：在matrigel组，与转染对照质粒的细胞相比，转染SOX3过表达质粒的HO8910细胞粘附能力下降24.1%(P＜0.01)；转染SOX3降调shRNA质粒的SKOV3和SKOV3-ip细胞粘附能力分别增加18.2%(P＜0.01)及16.6%(P＜0.01)。在laminin组，与转染对照质粒的细胞相比，转染SOX3过表达质粒的HO8910细胞粘附能力下降26.4%(P＜0.01)；转染SOX3降调shRNA质粒的SKOV3和SKOV3-ip细胞粘附能力分别增加33.7%(P＜0.01)及33.9%(P＜0.01)。　　第三部分 SOX3通过靶向Src激酶促进上皮性卵巢癌细胞的转移　　1.目的：探讨SOX3调控上皮性卵巢癌细胞转移机制，分析SOX3与Src激酶之间的关系。　　2.方法：构建SOX3过表达HO8910稳转细胞株。使用Western blot、Transwell小室方法检测SOX3促进迁移侵袭的相关机制。　　3.结果：　　（1）SOX3促进上皮性卵巢癌细胞转移相关蛋白磷酸化。在稳定过表达SOX3的HO8910细胞中，Src、FAK、以及其下游分子p130-cas的磷酸化水平增加；而抑制SOX3表达的SKOV3和SKOV3-ip细胞中，Src、FAK、以及其下游分子p130-cas的磷酸化水平降低。　　（2）降调Src可促进上皮性卵巢癌细胞粘附以及抑制其侵袭和转移。通过siRNA降调了稳定过表达SOX3的HO8910细胞的Src水平，并通过Western blot实验证实。通过transwell实验发现，在稳定过表达SOX3的HO8910细胞中，如果降调Src，会抑制上皮性卵巢癌细胞迁移和侵袭，促进细胞粘附作用。此外，在稳定过表达SOX3的HO8910细胞中降调Src，p130-cas的磷酸化作用会减弱。