本论文分为五章:第一章为文献综述,第二章为基于药物体系的丹参饮药物提取工艺研究,第三章为基于药物体系的丹参饮药物分离富集工艺研究,第四章为基于药物体系的丹参饮药物质量控制技术方法研究,第五章为总结与创新点。第一章 文献综述对近年来丹参饮及其单味药材丹参、檀香、砂仁化学成分和药理作用进行了综述,共引用文献51篇。第二章 基于药物体系的丹参饮药物提取工艺研究采用课题组建立的PK-PD-DI药物体系研究模式,前期对本方药物体系了研究:确定出本方提取物化学组成及其入血形式(原型及代谢);同时进行了药效学指标的考察及抗心肌缺血动态药学-药效作用评价,对其自然性、协同性、亲和性按单一成分、单一化学类型分别进行考量,找到其成分之间、化学类型之间相关性。发现与确定本方抗心肌缺血药物体系主要组成为:酚类、二萜醌类、萜类等。本章基于基于前期研究结果,以药物体系为导向,对丹参饮提取物的提取工艺进行了优选。采用L,(43)正交设计试验方法,以挥发油出油量(萜类所在部位)、总酚提取量、总二萜醌提取量为指标,对提取溶剂(A)、溶剂倍量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)等4个因素进行考察。以总酚及其指标性成分提取量为指标进行分析,因素A、B、C、D均有显著性差异,最佳提取工艺条件为:Aa～bBc>dCeDf;以总二萜醌提取量及其指标性成分为考察指标进行分析,因素A、B有显著性差异,因素C、D无显著性差异,最佳提取工艺条件为:Ab>aBc>dCe>g>hDf>i>j。综合分析正交试验结果,并结合实际生产,确定丹参饮提取物最佳提取工艺条件为:AbBcCeDf,即檀香、砂仁浸泡k小时,m倍溶剂提取n小时,提取挥发油后,药渣与丹参合并,b%乙醇回流提取f次,每次提取e小时,溶剂用量为c倍量。第三章 基于药物体系的丹参饮药物分离富集工艺研究本章基于基于前期研究结果,以药物体系为导向,对丹参饮总酚和总二萜醌有效物质富集工艺进行了研究。以总酚和总二萜醌的吸附量和吸附-解吸率及转移率为考察指标,对树脂类型进行筛选,通过测定分析6种不同类型大孔吸附树脂对总二萜醌和总酚的吸附特性与解吸附特性,得出AB-8型大孔吸附树脂对总酚和总二萜醌的吸附量较大,解吸附较容易,吸附后洗脱物中总酚和总二萜醌的含量较高。最终选择AB-8型大孔吸附树脂作为富集丹参饮有效物质的树脂。进而以总酚和总二萜醌的含量及转移率为主要考察指标对AB-8型大孔吸附树脂富集工艺进行研究,分别对其吸附条件、除杂条件、洗脱条件进行优化,包括上样液浓度、上样量与树脂体积比、树脂柱径高比、吸附流速、最大上样量;水洗倍量、水洗流速;洗脱溶剂、洗脱流速、洗脱倍量等参数的考察,确定最佳树脂富集工艺为:丹参饮提取物用水分散,制成浓度为pg/mL(以生药量计)的上样液,通过AB-8型大孔吸附树脂进行吸附,上样量与树脂体积比为q,树脂柱径高比为r,吸附流速为是sBV/h;吸附完毕后,用t倍树脂体积水洗脱除杂,水洗流速为uBV/h;水洗除杂完毕后,用V%乙醇洗脱w倍树脂体积,洗脱流速为uBV/h,收集v%乙醇洗脱液,减压回收溶剂,真空干燥,即得丹参饮酚类富集物;再用x%乙醇洗脱y倍树脂体积,洗脱流速为uBV/h,收集x%乙醇洗脱液,减压回收溶剂,真空干燥,即得丹参饮二萜醌类富集物。对丹参饮酚类富集物及二萜醌类富集物提取富集工艺进行了验证。3批样品的制备和含量测定结果表明,丹参饮酚类富集物及二萜醌类富集物提取富集工艺合理、稳定。丹参饮酚类富集物平均得率为7.30%,总酚平均含量为44.10%,平均提取率为97.20%,转移率在65.82%以上;丹酚酸B平均含量为2.96%,平均提取率为97.09%,转移率在60.58%以上。丹参饮二萜醌类富集物平均得率为1.35%,总二萜醌平均含量为2.81%,平均提取率为89.11%,转移率在62.08%以上;丹参酮ⅡA平均含量为1.28%,平均提取率为92.70%,转移率在60.02%以上,挥发油平均得率为6.5%。结果均基本稳定,符合要求。对丹参饮水提物、醇提物、富集物进行了药效验证。采用大鼠舌下静脉注射脑垂体后叶素造成急性心肌缺血模型,选择血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)作为衡量心肌缺血损伤的生化指标,通过对数据分析得出,模型对照组大鼠CK、LDH明显高于(P<0.01)正常对照组,说明舌下静脉注射脑垂体后叶素造成急性心肌缺血模型成功。丹参饮水提物组、醇提物组和富集物组大鼠CK、LDH含量明显低于模型对照组(P<0.01),说明丹参饮各制备物对模型大鼠心肌缺血损伤均有治疗作用。在相同生药量剂量下,丹参饮水提物组(出膏率48.7%)给制备物药量为1.2g/kg,醇提物组(出膏率40%)给制备物药量为1.46g/kg,而富集物组(出膏率8.65%)给制备物药量仅为0.26g/kg(皆按照正常人体等比例换算后的给药剂量),可以看出丹参饮富集物组给药物量小,药效佳。第四章 基于药物体系的丹参饮药物质量控制技术方法研究本章基于基于前期研究结果,以药物体系为导向建立了高效液相色谱法测定丹参饮二萜醌类制备物中总二萜醌的含量测定方法,以丹参酮ⅡA为对照品的回归方程为Y=3956994.24X+14218.87,r=0.9997(n=10),表明丹参酮ⅡA在0.04 μg 0.4μg的质量范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。丹参酮ⅡA平均加样回收率为98.95%,RSD为2.86%。测得丹参饮二萜醌类富集物中总二萜醌含量为2.73%2.87%之间。3批样品的含量测定结果表明,该方法准确、可靠、稳定性好,可作为丹参饮二萜醌类制备物中总二萜醌质量控制的有效方法。建立了丹参饮二萜醌类制备物中主要指标性成分丹参酮ⅡA的HPLC定量方法,丹参酮 ⅡA 的回归方程为 Y=3956994.24X+14218.87,r=0.9997(n=10),表明丹参酮 ⅡA在0.04 μg 0.4 μg的质量范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。丹参酮ⅡA平均加样回收率为98.95%,RSD为2.86%。测得丹参饮二萜醌类富集物中丹参酮ⅡA含量为1.23%1.27%之间。对3批丹参饮二萜醌类制备物中丹参酮ⅡA进行含量测定,结果表明该方法准确、简便、稳定,可作为丹参饮二萜醌类制备物中丹参酮ⅡA质量控制的有效方法。采用可见分光光度法对丹参饮酚类制备物中总酚进行定量分析,并对三氯化铁-铁氰化钾显色反应进行了方法学考察。以丹酚酸B为对照品对总酚进行定量分析,建立的丹酚酸B线性回归方程为Y=15.625X+0.15,r=0.9975(n=6),表明丹酚酸B在0.0128mg 0.4608 mg的浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。丹酚酸B平均加样回收率为100.11%,RSD为2.88%。测得丹参饮酚类富集物中总酚含量为43.64%-44.67%之间。3批样品的含量测定结果表明,该方法准确、可靠、稳定性好,可作为丹参饮酚类制备物中总酚质量控制的有效方法。建立了丹参饮酚类制备物中指标性成分丹酚酸B的HPLC定量方法,并对丹参饮酚类富集物、提取物进行了含量测定。丹酚酸B的线性回归方程为Y=20,111,386.9286 x-6,512,362.2000,r=0.9998(n=6)。实验结果表明丹酚酸 B 在0.4 μ g 2.4μg 的质量范围内与色谱峰面积呈良好的线性关系。丹酚酸B的平均回收率为102.13%,RSD为2.36%。测得丹参饮酚类富集物中丹酚酸B含量为2.95.%3.03%之间。对3批丹参饮酚类富集物及提取物中丹酚酸B进行含量测定,结果表明该方法准确、简便、稳定,可作为丹参饮酚类制备物中丹酚酸B质量控制的有效方法。第五章 总结与创新点1.首次应用新的中药有效物质基础-药物体系发现新模式,阐明丹参饮方剂中药物的自然化学属性,阐明药物类药有效物质基础、药物类药动态属性与协同作用特性以及药物动态效应属性及其协同作用特性。2.论文基于前期药物体系研究结果,继续研究建立了丹参饮提取工艺方法及其酚类有效物质、二萜醌类有效物质的提取、富集工艺方法及其挥发油(萜类所在部位)提取方法。3.采用可见分光光度法和高效液相色谱法,分别建立了有效物质中总酚和总二萜醌及指标性成分丹酚酸B、丹参酮ⅡA的含量测定方法,作为丹参饮有效物质质量控制指标,为进一步进行创新药物的开发研制,制定科学、合理、严格的质量控制标准和评价体系奠定了基础。