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神经病理性疼痛(neuropathic pain)发病率高,发病机制复杂,疼痛剧烈,治疗困难,是当今临床医疗面临的严峻挑战之一,亟待研发新型防治药物。钩吻素子(koumine)是我国历史悠久的药用植物钩吻(Gelsemium elegans Benth.)生物碱成份之一,含量最高而毒性较低。本课题组前期工作提示钩吻素子具有抗慢性疼痛的潜能,但其抗神经病理性疼痛作用有待进一步明确,作用机制有待于阐释。脊髓背角是外周神经病理性疼痛的重要调控部位。近年来日益关注脊髓胶质细胞在神经病理性疼痛中的调控作用。脊髓胶质细胞活化,释放大量促炎细胞因子如TNF-α和IL-1β等,在神经病理性疼痛的发生与维持中发挥重要作用,此为其痛敏发生的重要机制。活化的脊髓胶质细胞是否存在内源性代偿性对抗这种致痛敏作用,即同时存在抗痛敏机制?值得思考探究。脊髓神经活性甾体抗神经病理性疼痛作用日益受到重视。TSPO[translocator protein(18 k Da)]在中枢主要分布于胶质细胞,其重要功能为促进神经活性甾体的生成,增强TSPO可对抗神经病理性疼痛的痛敏状态,其介导的抗痛敏途径可能为TSPO-别孕烯醇酮-GABAA受体-镇痛。本文首先拟在3种外周神经病理性疼痛大鼠模型上,进一步明确钩吻素子抗外周神经病理性疼痛的作用,以期提出钩吻素子抗神经病理性疼痛作用的可能新功效。在此基础上,一方面从抑制致痛敏角度,探讨钩吻素子抗外周神经病理性疼痛作用与其调节脊髓促炎细胞因子水平的关系,进而观察钩吻素子可否抑制神经病理性疼痛模型大鼠脊髓神经胶质细胞的活化,并分析其抗神经病理性疼痛作用与之相关性;另一方面从增强抗痛敏角度,探讨钩吻素子抗神经病理性疼痛作用与其提高脊髓别孕烯醇酮水平的关系,进而探讨钩吻素子抗神经病理性疼痛作用是否与其增强脊髓TSPO及其介导的抗痛敏途径有关,以期较为全面阐释钩吻素子抗神经病理性疼痛作用的脊髓分子机制,为防治神经病理性疼痛的新药研发提供新的药物作用靶标与新的药物作用途径,并有助于深化理解神经病理性疼痛的中枢机制。主要研究内容如下:1钩吻素子对大鼠神经病理性疼痛的镇痛作用1.1钩吻素子对坐骨神经慢性束缚损伤模型大鼠的镇痛作用在大鼠坐骨神经慢性束缚损伤(chronic constriction injury,CCI)模型,以机械刺激阈值为指标,观察钩吻素子对CCI模型大鼠的镇痛作用。实验动物随机分为假手术组、模型组、钩吻素子处理组(0.28、1.4和7.0 mg/kg)以及阳性药加巴喷丁对照组(40 mg/kg),术后D3起,皮下注射相应药物或溶媒干预,一天两次,连续7 d。在术前、术后D3和术后D5、D7、D9上午给药后1 h时,测定痛阈。结果显示,钩吻素子具有显著的抗CCI大鼠机械刺激诱发痛的作用,呈时间依赖性和剂量依赖性。钩吻素子7.0 mg/kg本身对假手术组大鼠痛阈无影响。1.2钩吻素子对坐骨神经分支选择性损伤模型大鼠的镇痛作用在大鼠坐骨神经分支选择性损伤(spared nerve injury,SNI)模型,以机械刺激阈值为指标,观察钩吻素子对SNI模型大鼠的镇痛作用。实验动物随机分为假手术组、模型组、钩吻素子处理组(0.6和3.0 mg/kg)以及加巴喷丁对照组(800 mg/kg),手术后D3起,灌胃给予相应药物或溶媒干预,一天两次,连续7 d。在术前、术后D3和术后D5、D7、D9上午给药后1 h时,测定痛阈。结果显示,钩吻素子具有显著的抗SNI大鼠机械刺激诱发痛的作用,呈时间依赖性和剂量依赖性。1.3钩吻素子对链脲佐菌素致糖尿病性神经病理性疼痛模型大鼠的镇痛作用在大鼠链脲佐菌素(streptozocin,STZ)致糖尿病性神经病理性疼痛(diabetic neuropathic pain,DNP)模型,以机械刺激阈值为指标,观察钩吻素子对STZ致DNP模型大鼠的镇痛作用。实验动物随机分为对照组、模型组、钩吻素子处理组(0.28、1.4和7.0 mg/kg)以及加巴喷丁对照组(100 mg/kg),STZ给予后D22起,灌胃给予相应药物或溶媒干预,一天一次,连续8 d。在给予STZ前和给予后的D21、D22、D24、D26和D28给药后1 h测定机械刺激痛阈,观察钩吻素子对DNP模型大鼠机械刺激诱发痛的作用。结果显示,钩吻素子具有显著的抗DNP大鼠机械刺激诱发痛的作用,呈时间依赖性和剂量依赖性。2钩吻素子对神经病理性模型大鼠脊髓促炎细胞因子水平的影响2.1钩吻素子对SNI大鼠脊髓TNF-α和IL-1β水平的影响行为学实验结束后,取假手术组、模型组和钩吻素子处理组大鼠L4-6脊髓,酶联免疫吸附法测定TNF-α和IL-1β水平。结果显示SNI大鼠脊髓TNF-α和IL-1β水平升高;钩吻素子剂量依赖性降低脊髓TNF-α和IL-1β水平,该作用与钩吻素子对SNI大鼠痛敏的缓解作用,呈负相关。2.2钩吻素子对STZ致DNP大鼠脊髓TNF-α和IL-1β水平的影响行为学实验结束后,取对照组、模型组和钩吻素子处理组大鼠L4-6脊髓,酶联免疫吸附法测定TNF-α和IL-1β水平。结果显示DNP大鼠脊髓TNF-α水平有升高的趋势;钩吻素子有降低脊髓TNF-α水平的趋势,该作用与钩吻素子对DNP大鼠痛敏的缓解作用相关系数为-0.339(P=0.114)。DNP大鼠脊髓IL-1β水平有升高的趋势;钩吻素子剂量依赖性降低脊髓IL-1β水平,该作用与钩吻素子对DNP大鼠痛敏的缓解善作用,呈负相关。3钩吻素子对神经病理性疼痛大鼠脊髓星形胶质细胞活化的作用行为学实验结束后,假手术组、模型组和钩吻素子处理组大鼠经灌注固定后,取脊髓,荧光免疫组织化学法和蛋白质分子印迹法,研究钩吻素子对SNI大鼠脊髓星形胶质细胞活化的作用。结果显示SNI大鼠术侧脊髓尤其术侧脊髓背角浅层GFAP免疫荧光强度增高,星形胶质细胞激活,阳性细胞数量增多,GFAP表达增加;SNI大鼠非术侧未见此变化。钩吻素子3.0 mg/kg处理后,术侧脊髓免疫荧光强度减弱,细胞形态趋向静止型,阳性细胞数量减少,GFAP表达降低。4钩吻素子对神经病理性疼痛模型大鼠脊髓别孕烯醇酮水平影响4.1钩吻素子对CCI大鼠脊髓别孕烯醇酮水平的影响行为学实验结束后,取假手术组、模型组和钩吻素子各处理组大鼠L4-6脊髓,液相色谱-质谱联用测定脊髓别孕烯醇酮含量。结果显示,CCI模型组大鼠脊髓别孕烯醇酮含量增高,经钩吻素子处理大鼠脊髓别孕烯醇酮含量进一步剂量依赖性增高。钩吻素子提高CCI大鼠脊髓别孕烯醇酮水平与其缓解CCI大鼠痛敏状态,呈正相关。4.2钩吻素子对SNI大鼠脊髓别孕烯醇酮水平的影响行为学实验后,取假手术组、模型组和钩吻素子各剂量处理组大鼠L4-6术侧脊髓,酶联免疫吸附法测定术侧脊髓别孕烯醇酮含量。结果显示,SNI模型组大鼠脊髓别孕烯醇酮含量有增高趋势,经钩吻素子处理大鼠脊髓别孕烯醇酮含量进一步剂量依赖性增高。钩吻素子提高SNI大鼠脊髓别孕烯醇酮水平与其缓解SNI大鼠痛敏状态,呈正相关。4.3钩吻素子对DNP大鼠脊髓别孕烯醇酮水平的影响行为学实验后,取假手术组、模型组和钩吻素子各剂量处理组大鼠L4-6脊髓,酶联免疫吸附法测定脊髓别孕烯醇酮。结果显示,DNP大鼠脊髓别孕烯醇酮含量有降低的趋势,经钩吻素子处理大鼠脊髓别孕烯醇酮含量剂量依赖性增高。钩吻素子提高DNP大鼠脊髓别孕烯醇酮水平与其缓解DNP大鼠痛敏状态,呈正相关。5钩吻素子抗神经病理性疼痛作用与脊髓TSPO及其介导的分子通路的关系5.1脊髓鞘内注射PK11195对钩吻素子抗大鼠神经病理性疼痛效应的影响采用TSPO阻断剂PK11195,以机械刺激痛阈为指标,观察i.t.PK11195对钩吻素子抗CCI大鼠NP作用的影响。大鼠分次行鞘内置管术和CCI术。实验动物随机分为溶媒对照组、钩吻素子处理组、PK11195处理组(0.04、0.2和1.0μg)以及PK11195对照组(1.0μg)。各组i.t.PK11195或溶媒,s.c.钩吻素子7.0 mg/kg或溶媒,1 h后测痛阈。结果显示,钩吻素子处理组痛阈增高,PK11195 1.0μg翻转钩吻素子的作用,而本身不影响CCI大鼠痛阈。5.2脊髓鞘内注射普维拉对钩吻素子抗大鼠神经病理性疼痛效应的影响采用神经甾体合成酶抑制剂普维拉(provera),以机械刺激痛阈为指标,观察普维拉对钩吻素子抗CCI大鼠NP作用的影响。大鼠分次行鞘内置管术和CCI术。实验动物随机分为溶媒对照组、钩吻素子处理组、provera处理组(2.5、5.0和12.5μg)以及provera对照组(12.5μg)。各组i.t.provera或溶媒,30 min后s.c.钩吻素子7.0 mg/kg或溶媒,1 h后测痛阈。结果显示,钩吻素子处理组痛阈增高,provera(5.0和12.5μg)翻转钩吻素子的作用,provera(12.5μg)本身不影响CCI大鼠痛阈。5.3脊髓鞘内注射17PA对钩吻素子抗大鼠神经病理性疼痛效应的影响采用别孕烯醇酮拮抗剂且为GABA受体阻断剂3α,5α-17-苯基雄甾-16-烯-3-醇(3α,5α-17-phenylandrost-16-en-3-ol,17PA),以机械刺激痛阈为指标,观察17PA对钩吻素子抗CCI大鼠NP作用的影响。大鼠分次行鞘内置管术和CCI术。实验动物随机分为溶媒对照组、钩吻素子处理组、17PA处理组(0.5、1.0、2.5和12.5μg)以及17PA对照组(12.5μg)。各组i.t.17PA或溶媒,30 min后s.c.钩吻素子7.0 mg/kg或溶媒,1 h后测痛阈。结果显示,钩吻素子处理组痛阈增高,17PA(2.5,12.5μg)翻转钩吻素子的作用,17PA(12.5μg)本身不影响CCI大鼠痛阈。综上,钩吻素子具有抗神经病理性疼痛的作用;抑制脊髓星形胶质细胞活化、降低脊髓促炎细胞因子水平,可能是钩吻素子抗神经病理性疼痛的作用机制之一;钩吻素子抗神经病理性疼痛作用可能与其提高脊髓别孕烯醇酮水平有关;增强TSPO及其介导的分子通路(TSPO-别孕烯醇酮-GABAA受体),可能是钩吻素子抗神经病理性疼痛的分子机制之一。