膳食营养对慢性非传染性疾病的影响已日益受到关注。目前在慢性非传染性疾病中,恶性肿瘤在我国人群中居死因第一位。肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,中国是肝癌高发国家,其死亡率在恶性肿瘤中居第二位,因此HCC已经成为我国当前社会的重大疾病负担之一。在肝癌发展过程中,侵袭转移是影响肝癌患者预后的最主要因素。肝癌的侵袭转移是一个复杂多步骤连续过程,涉及肝癌生长迁徙等多个方面。同时,肿瘤的生长离不开新生血管的形成,血管生成在肝癌生长、增殖、转移和侵袭过程中发挥重要作用,控制肿瘤血管生成亦可以阻滞肝癌的发展。虽然目前对肝癌侵袭转移和血管生成过程已有较为广泛而深入的研究,但其分子机制仍不清楚;且传统药物在化疗过程中能够诱导癌细胞产生化疗抵抗,进而引起肿瘤的转移复发,且药物本身具有较大的毒副作用,导致疗效迄今无明显改善。膳食因子对肿瘤干预作用正日益受到关注,因此,作为肿瘤治疗新视野,应用膳食中的生物活性成分抑制肝癌侵袭转移,进而控制肝癌进程已发展为重要的抗癌策略。方法一、CaA处理人肝癌细胞株常规培养人肝癌HepG2、MHCC97H和HuH7细胞株24 h后,再分别用0.0或20 μM CaA或联合100 μMCoCl2处理8、16或24h。观察细胞相关细胞因子和相关通路/分子以及血管生成、侵袭转移及肿瘤干细胞样特性的变化情况。二、CCK-8法检测细胞活力应用碧云天公司生产的CCK-8 kit,在细胞培养体系中加入10%体积浓度的CCK-8反应4 h后,在酶标仪上450 nm波长处读取吸光度值。三、细胞转染实验将H细胞常规培养24 h后,将相关蛋白特异性siRNA加入LipofectamineTM 2000试剂中转染细胞12 h。四、实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)提取细胞总RNA并测定其浓度,逆转录成cDNA后,分别应用VEGF、HIF-1 α、CD44、EpCAM、Oct4、BMI1 和 14-3-3η 引物通过 ABI-7300 定量 PCR 仪检测。五、Westen blot及灰度值(光密度)分析提取细胞蛋白并测定浓度,SDS-PAGE分离蛋白后经半干法转膜,用特异性一抗4 ℃孵育过夜,进一步常温结合二抗1h后,用增强型化学发光法检测相关蛋白表达及磷酸化水平。灰度值应用Image-Pro-Plus 6.0软件定量分析六、免疫共沉淀提取细胞总蛋白,用IP抗体与蛋白混合过夜将靶蛋白沉淀后,用Western blot法检测蛋白-蛋白相互作用。七、酶联免疫吸附法(ELISA)将受检样本与固相抗体接触反应后加入酶标抗体。加底物定量以对照组的吸光度值定为100%,计算相对蛋白分泌水平。八、染色质免疫共沉淀(ChIP)提取细胞总蛋白,用Ip抗体与蛋白混合过夜将靶蛋白沉淀,通过超声震荡进而提取与靶蛋白结合的DNA后,用PCR法检测蛋白-DNA相互作用。九、小管形成实验处理细胞后收集条件培养液,在铺matrigel的96孔板中孵育HUVECs细胞6 h,镜下观察小管形成情况并拍照并通过S.CORE法定量。十、内皮细胞趋化实验应用Corning双层小室技术共培养HCC和HUVECs细胞(上层:HUVECs,下层:HCC细胞)24 h后,通过结晶紫染色法观察穿透小室基底膜的HUVECs细胞并拍照,运用Image-Pro-Plus 6.0定量分析。十一、明胶酶谱法收集细胞培养液,离心后运用含1 mg/ml明胶的SDS-PAGE电泳,在37℃无CO2条件下继续孵育2 h,通过考马斯亮蓝染色观察明胶酶MMP-9活性。十二、Transwell应用Corning双层小室技术在上层培养HCC细胞,下层培养液中加入100 ng/ml EGF,孵育24 h后通过结晶紫染色法观察穿透小室基底膜的细胞并拍照,运用Image-Pro-Plus 6.0定量分析。十三、悬浮集落形成实验将细胞接种至低粘附培养皿中,用含10 ng/ml EGF和10ng/ml FGF无血清DMEM-F12培养液每2天进行一次半定量换液,连续培养2周。十四、软琼脂集落形成实验将细胞与含0.7%低熔点琼脂糖的DMRM培养液等体积混合后,铺于含0.7%低熔点琼脂糖的底层培养基上,待其凝固后,覆以适量培养液,37℃、5%CO2培养,每3-4 d换液一次,2 w后终止培养并计数细胞集落数。十五、裸鼠皮下移植瘤接种、CaA处理和免疫组化实验将HCC细胞按5x106/0.2 mL密度注射于Balb/c裸鼠右侧腋窝皮下成瘤后,应用10mg.kg-1 CaA每周两次灌胃处理11周,在饲养过程中每周测量肿瘤体积。饲养结束后,处死裸鼠,去肿瘤固定并作组织切片免疫组化,运用快速评分法定量相关蛋白表达水平以及微血管密度。十六、数据统计分析实验所得统计数据用均数±标准差表示,SPSS 13.0软件双侧t检验或单因素方差分析(one-way analysis of variance,ANOVA)法分析组间统计学差异,设定p<0.05则认为有统计学显著性差异。结果一、缺氧条件下CaA对HCC细胞促血管生成能力的影响应用100 μM CoCl2联合20μCaA处理人肝癌HepG2和MHCC97H细胞,发现:CaA可显著抑制化学缺氧(CoCl2)诱导的两种HCC细胞VEGF的表达、分泌以及促血管生成能力。二、缺氧条件下CaA对HCC细胞HIF-1α的影响应用100 μM CoCl2联合20 μM CaA处理人肝癌HepG2和MHCC97H细胞,发现:CaA对化学缺氧(CoCl2)诱导HIF-1α mRNA表达水平升高无明显影响,然而对HIF-1α蛋白表达水平存在显著的抑制作用。三、缺氧条件下CaA对HCC细胞HIF-1α/VEGF的调控机制应用100 μM CoCl2联合20 μM CaA处理人肝癌HepG2和MHCC97H细胞,发现:CaA可通过抑制JNK1介导的HIF-1α蛋白稳定性,同时通过增加HIF-1α蛋白的泛素化水平诱导HIF-1α降解,继而抑制HIF-1α的表达水平,进而抑制HIF-1α与VEGF的启动子区结合,转录抑制VEGF的表达和分泌。四、CaA对HCC细胞裸鼠皮下移植瘤的影响体内移植瘤模型发现:CaA显著抑制移植瘤的生长和血管生成,免疫组化实验证实CaA可在体内抑制JNK1磷酸化,抑制HIF-1α和STAT3以及VEGF的表达水平。五、常氧条件下CaA对HCC细胞血管生成、侵袭转移以及肿瘤干细胞(CSCs)样特性的影响应用20 μM CaA处理人肝癌HepG2、MHCC97H和HuH7细胞,发现:CaA可显著抑制肝癌细胞的促血管生成能力、侵袭转移性以及CSCs样特性。六、14-3-3η在CaA抑制HCC细胞血管生成、侵袭转移以及CSCs样特性中的作用通过转染14-3-3η-siRNA后发现:与NC-siRNA转染组相比,敲除14-3-3η可显著抑制HCC细胞的促血管生成能力、侵袭转移性以及CSCs样特性;同时CaA在NC-siRNA转染细胞中可显著抑制HCC细胞的上述三种肿瘤分子生物学行为,然而敲除14-3-3η后,CaA对以上生物学行为的抑制程度则显著降低。七、CaA对14-3-3η的潜在调控机制进一步研究发现:CaA可通过抑制14-3-3η与ERK形成正反馈环路,转录抑制14-3-3η mRNA的表达水平;同时,CaA亦可通过泛素化依赖的方式加速14-3-3η 的降解,转录后抑制14-3-3η蛋白的表达水平。结论1.在缺氧条件下,CaA可通过抑制JNK1介导的HIF-1α蛋白稳定性,同时通过增加HIF-1α蛋白的泛素化水平诱导HIF-1α降解;2.JNK1/HIF-1α信号通路在CaA抑制缺氧诱导的HCC细胞促血管生成过程中发挥重要作用;3.在常氧条件下,CaA亦可抑制HCC细胞的促血管生成能力、侵袭转移性和CSCs样特性;4.CaA可通过抑制ERK和泛素化依赖的方式,在转录和转录后两个水平调控14-3-3η;5.14-3-3η在维持HCC细胞的促血管生成能力、侵袭转移性以及CSCs样特性过程中发挥重要作用;6.14-3-3η在CaA抑制HCC细胞促血管生成能力、侵袭转移性和CSCs样特性过程中发挥重要作用。