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目的本实验通过牙龈卟啉单胞菌(Porphvromonas gingivalis.P.gingivalis)W83涂抹小鼠口腔的方法建立牙周炎小鼠模型,采用腹腔注射GITR抗体阻断Treg细胞功能的方法,研究Treg细胞对牙周炎小鼠中M1型巨噬细胞介导免疫应答的影响。方法1、将20只7周龄SPF级C57BL/6雌性小鼠随机分为4组,每组5只:正常对照组,单纯牙周炎组,Ig G组和anti-GITR m Ab组。2、以P.gingivalis W83连续口腔涂抹7天的方法建立小鼠牙周炎模型。Anti-GITR m Ab组小鼠于口腔涂抹P.gingivalis W83第1天开始,每隔3天腹腔注射anti-GITR m Ab(100μg/mice),共4次。Ig G组小鼠腹腔注射Ig G同种型对照抗体(100μg/mice)。3、动态监测4组小鼠的体重变化,于感染后第45天取材。4、体式显微镜下观察小鼠的牙龈指数和牙齿松动度。5、体式显微镜下测量釉质牙骨质界(cemento-enamel junction,CEJ)到牙槽嵴顶(alveolar bone crest,ABC)间的距离评价牙槽骨的吸收情况。6、苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色法观察牙周组织中炎细胞浸润、结缔组织附着丧失和牙槽骨吸收情况。7、实时定量RT-PCR检测IL-10、TGF-β1、Foxp3和i NOS m RNA的相对表达水平。结果1、与正常对照组相比,在D14单纯牙周炎组、Ig G组和anti-GITR m Ab组小鼠的体重开始有下降趋势,单纯牙周炎和Ig G组小鼠体重下降无明显差异(P>0.05),anti-GITR m Ab组小鼠的体重下降差异明显(P<0.05)。在D35,与正常对照组相比,单纯牙周炎组、Ig G组和anti-GITR m Ab组小鼠的体重下降差异明显(P<0.01);与单纯牙周炎组、Ig G组相比,anti-GITR m Ab组小鼠的体重下降有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。2、单纯牙周炎组、Ig G组和anti-GITR m Ab组小鼠牙龈指数数值与正常对照组小鼠相比增大,差异显著(P<0.01);而anti-GITR m Ab组小鼠牙龈指数大于单纯牙周炎组和Ig G组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。与正常对照组小鼠相比,单纯牙周炎组、Ig G组和anti-GITR m Ab组小鼠牙齿的松动度显著升高,差异明显(P<0.01);其中anti-GITR m Ab组小鼠牙齿松动度大于单纯牙周炎组和Ig G组,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。3、测量釉质牙骨质界到牙槽嵴顶间距离结果显示:与正常对照组相比,单纯牙周炎组、Ig G组和anti-GITR m Ab组小鼠釉质牙骨质界到牙槽嵴顶的距离均有增加(P<0.01),anti-GITR m Ab组小鼠比单纯牙周炎组、Ig G组小鼠牙槽嵴顶到釉牙骨质界的距离增大(P<0.05,P<0.01)。4、苏木素-伊红染色结果显示正常对照组:沟内上皮完整,结合上皮位置正常,牙龈上皮内未见炎症细胞浸润,牙周膜纤维排列整齐,牙槽骨边缘清晰完整,未见破骨细胞。单纯牙周炎组和Ig G组:沟内上皮出现糜烂或溃疡,一部分上皮向结缔组织内增生有炎症细胞浸润,并见一部分炎性细胞及渗出物移出至牙周袋内。结合上皮向根方增殖、延伸,形成牙周袋,其周围有炎症细胞浸润。沟内上皮及结合上皮下方的胶原纤维水肿、变性,有的部分已被炎症细胞取代。牙槽嵴顶及固有牙槽骨有吸收。anti-GITR m Ab组:沟内上皮出现糜烂,大部分上皮向结缔组织内增生,有大量的炎症细胞浸润,大有部分炎症细胞及渗出物移至牙周袋内,结合上皮根方增殖,形成深牙周袋。结合上皮下胶原纤维丧失,大部分已被炎症细胞取代。牙槽骨出现明显骨吸收陷窝,周围可见大量破骨细胞,固有牙槽骨吸收、破坏严重。5、实时定量RT-PCR的方法检测结果显示:与正常对照组相比,单纯牙周炎组、Ig G组和anti-GITR m Ab组小鼠牙龈组织中Treg细胞相关因子IL-10、TGF-β1和Foxp3 m RNA的表达水平均增高(P<0.05),M1型巨噬细胞相关因子i NOS m RNA的表达水平增高(P<0.01)。与单纯牙周炎组和Ig G组相比,anti-GITR m Ab组小鼠牙龈组织中Treg细胞相关因子IL-10、TGF-β1和Foxp3m RNA的表达水平降低(P<0.05),M1型巨噬细胞相关因子i NOS m RNA的表达水平增高(P<0.05)。结论1、在实验性牙周炎中,M1型巨噬细胞介导的免疫应答增强,M1型巨噬细胞参与牙周组织的炎症反应和组织损伤。2、在实验性牙周炎中,Treg细胞能够下调M1型巨噬细胞介导的免疫应答,减轻牙周炎的炎症程度和组织损伤。