氢水（Hydrogen-Rich Water，HRW）具有抗氧化应激损伤、抗炎的作用，且在脑组织缺血再灌注损伤中表现出神经保护作用。钙缓冲蛋白，包括小白蛋白和海马钙蛋白，在神经元的分化、成熟和凋亡过程中具有重要的生理作用。有研究指出小白蛋白和海马钙蛋白的表达增加可以减轻脑缺血损伤的严重程度，并改善因缺血损伤诱发的细胞内钙超载的形成，减轻神经细胞缺血损伤。脑缺血后神经元经受氧化应激损伤可造成细胞内钙离子增加，钙缓冲蛋白可降低细胞内升高的钙离子，而氢水抗氧化应激的神经保护作用与钙缓冲蛋白的表达之间是否有联系目前尚无研究。我们的实验的目的是探讨氢水在动物脑缺血损伤和谷氨酸毒性诱发的神经细胞死亡过程中是否可以通过调节小白蛋白和海马钙蛋白的表达，进而起到改善脑缺血损伤程度和神经细胞保护的作用。我们应用雄性 C57BL/6J小鼠制作大脑中动脉栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）的动物模型，在模型制作前及栓塞后对小鼠灌胃纯水或者氢水（6 ml/kg）处理，并于脑缺血后1、7、14天收集小鼠脑组织进行观察研究。我们的氢水由北京活力氢源科技有限公司制作提供，其基本制作原理是利用超声震荡的手段将物理溶解于纯水中的氢气大气泡震荡粉碎成更小更稳定的气泡，从而大大提高氢气在水中的溶解度，本实验中氢水中氢气的浓度可达到0.63-0.82 mmo l/L。我们的研究结果显示，动物脑缺血损伤后行氢水治疗可以有效减少脑组织梗死体积，改善神经功能。相较于纯水对照组，氢水不但可以改善动物缺血损伤后继发的小白蛋白和海马钙蛋白的表达量下降，而且可以改善谷氨酸毒性诱导的神经元死亡及这两种钙缓冲蛋白的表达，显示出神经保护作用，且这种作用呈氢水剂量依赖性。此外，氢水治疗可以减少谷氨酸毒性诱导的神经元胞内钙离子浓度的增加水平，抑制损伤神经元内小白蛋白及海马钙蛋白表达量的下降。以上研究结果说明，氢水对于脑缺血损伤有保护作用，且氢水维持脑缺血损伤后小白蛋白及海马钙蛋白的表达水平进而减轻神经元的损伤可能是其潜在机制。本研究共分为两部分：　　第一部分氢水对小鼠大脑中动脉栓塞导致的缺血性脑损伤的神经保护作用及其机制研究　　背景：缺血性脑损伤发病率高，预后一般较差，给患者及社会带来严重危害。以往的研究多关注于脑缺血的各种药物治疗，效果欠佳。脑组织缺血梗死后可形成多种氧自由基及钙超载，诱导氧化应激损伤，使梗死灶周围的“缺血半暗带”脑组织受到继发性损伤。近年来，有关氢水治疗脑缺血的研究日渐增多，氢水具有较强的还原性，可选择性拮抗生物体内的过多的氧自由基，具有抗氧化应激损伤的作用，且在脑组织缺血再灌注损伤中表现出神经保护作用。氢水的抗氧化应激损伤作用是否也会对受损的神经细胞内过量的钙离子产生影响，目前尚不可知。在此基础上，我们设计了本实验，进一步探讨氢水对实验动物脑缺血后梗死灶周边脑组织内钙离子水平的影响及其可能的机制。　　方法：本实验采用雄性C57BL/6J小鼠，所有动物随机分为假手术+纯水组，假手术+氢水组，MCAO+纯水组及MCAO+氢水组。对雄性C57BL/6J小鼠行大脑中动脉栓塞（MCAO）以建立缺血性脑损伤模型，造模前7天及造模后每天对小鼠行纯水或氢水灌胃（6 ml/k g体重），MCAO后24小时取脑行TTC染色观察脑组织缺血严重程度及氢水治疗效果，并于脑缺血后1、7、14天行神经功能评分检查及水迷宫实验检测小鼠认知行为学，然后处死小鼠并收集脑组织行免疫组化（Immunohistochemistry）及免疫印迹（Western blotting）实验检测小鼠脑组织皮层小白蛋白及海马内海马钙蛋白的表达情况。　　结果：我们的研究结果显示，动物脑缺血损伤后梗死灶较假手术组明显增大，相较于MCAO+纯水组动物，MCAO+氢水组小鼠脑组织梗死体积有效减少，神经功能评分及认知能力显著改善。此外，相较于纯水对照组，氢水可以改善动物缺血损伤后继发的小白蛋白和海马钙蛋白的表达量下降，显示出神经保护作用。以上结果差异均有统计学意义（p<0.05）。　　结论：体内动物实验显示氢水对于脑缺血损伤有保护作用，且氢水维持脑缺血损伤后脑组织内小白蛋白及海马钙蛋白的表达水平进而减轻神经元的损伤可能是其潜在机制。　　第二部分氢水对谷氨酸介导的原代神经元氧化应激损伤的神经保护作用及其机制研究　　背景：谷氨酸介导的原代神经元损伤可较好的模拟神经细胞缺血损伤的生理过程，是较为经典的细胞缺血损伤模型之一。脑组织缺血后神经元的氧化应激损伤及细胞内钙离子超载是神经细胞缺血的重要的病理生理过程。氢水被认为可以有效拮抗生物体内的氧化应激损伤作用，氢水的抗氧化应激损伤作用是否也会对受损的神经细胞内过量的钙离子产生影响，目前尚不可知。因此，我们设计了神经细胞缺血损伤的实验，从细胞水平进一步探讨氢水对神经元缺血损伤后神经细胞内钙离子水平的影响极其可能的机制。　　方法：本实验采用孕鼠(E18)脑组织皮层及海马的原代神经元进行培养，培养14天后随机分为阴性对照组、谷氨酸处理组、谷氨酸处理+0.625％氢水组、谷氨酸处理+1.25%氢水组及谷氨酸处理+2.5%氢水组，谷氨酸处理为在培养基内加入50μmo l/L的谷氨酸刺激细胞24小时，氢水加入时间点为谷氨酸处理前30分钟及处理后6小时、12小时及18小时这四个时间点。谷氨酸处理24小时后对细胞进行DAPI/PI免疫荧光双染检测细胞死亡情况，同时检测各组细胞内钙离子浓度水平，最后进行免疫印迹实验检测各组细胞内小白蛋白及海马钙蛋白的表达情况。　　结果：我们的研究结果显示，相较于阴性对照组，原代培养的神经元经谷氨酸处理后死亡率明显上升，细胞活性下降，细胞内钙离子浓度升高，小白蛋白及海马钙蛋白的表达量下降，而谷氨酸组经氢水处理后，随着加入氢水浓度的不断增加，实验组内的细胞相较于谷氨酸组细胞死亡率逐渐下降，细胞内钙离子浓度亦逐渐下降，小白蛋白及海马钙蛋白的表达量逐渐升高，且这一作用呈现出氢水剂量依赖性的特点。以上结果差异均有统计学意义（p<0.05）。　　结论：体外细胞实验显示氢水对于谷氨酸介导的原代神经元损伤有保护作用，可明显减少细胞死亡率，降低损伤细胞内的钙超载，且氢水维持损伤细胞内小白蛋白及海马钙蛋白的表达水平进而减轻神经元的损伤可能是其潜在机制。