地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)W10是从植物根际筛选获得的一株生防细菌,能较好地抑制多种植物病原真菌,田间防治效果明显。该菌生防机制主要是产生一种抗菌蛋白。为了进一步了解该菌生防机制和进行应用,本文对W10抗菌蛋白进行了纯化鉴定、编码基因克隆和蛋白表达分析,同时为了提高生防效果,本文还初步研究了其与水稻白叶枯病菌harpin蛋白Hpa1x∞的协同抗病作用,进而了解两类不同信号通路蛋白互作的分子机制,为这两类蛋白的应用奠定基础。利用硫酸铵沉淀和透析袋透析,从地衣芽孢杆菌W10培养上清滤液中获得抗菌粗蛋白,经AKTApurifier(HiPrep 16/60 Sephacryl S-100 High Resolution)进一步纯化,再将纯化的抗菌蛋白通过5800超高分辨飞行时间质谱仪(MALDI-TOF/MS-MS)进行质谱分析,根据Mascot搜索串级质谱数据鉴定为丝氨酸蛋白酶,并据此设计引物从W10基因组中获得全长序列,经测序含有1个ORF,编码基因1347 bp。经生物信息学分析,该基因编码448个氨基酸残基,分子量为48794.16 Da,等电点为6.04,是一种亲水性蛋白,在二级和三级结构中,a-螺旋和β-折叠所占比例相似,含有Peptidase_S8的保守结构域。通过载体构建,本文对W10抗菌蛋白编码基因进行了克隆,并在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌系统中进行了表达。其中,在大肠杆菌系统中未能成功表达,在枯草芽孢杆菌系统中成功表达,但是表达出的蛋白分子量与上述有点误差,且不具有抗菌活性,初步认为是在表达时氨基酸结构可能有所改变,从而影响了分子量与抗菌活性。同时丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对提取的抗菌蛋白有一定的抑制作用,进一步说明W10抗菌蛋白具有丝氨酸蛋白酶活性。此外,本文还研究了地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白与Hpa1x蛋白的协同抗病作用。两种蛋白混合处理与各自单独处理相比,能显著增加对番茄灰霉病的防治效果;防卫反应相关基因检测发现,在三生烟中,W10抗菌蛋白诱导了hsr203J、COI1、Ntexp2、Ntexp6基因不同程度的表达,分别涉及HR、茉莉酸信号通路以及植物生长调节基因,Hpa1x∞蛋白诱导了hsr203J、aoxl、Ntexp2、Ntexp6基因不同程度的表达,涉及HR、活性氧代谢及植物生长调节基因。W10抗菌蛋白与Hpa1x∞蛋白混合处理则在三生烟中诱导了上述所有基因不同程度的表达,且表达强度比单独处理有所增加。另外发现,W10抗菌蛋白在转hpalx∞基因烟草中能诱导hsr203J、Ntexp2、NtexC6、COI1、Chia5基因不同程度的表达。因此,这两类蛋白在混合应用时具有协同作用,通过增加相关信号通路和相关基因表达来提高对病害的防治作用。这将为整合生防资源提高生防效果,为开辟地衣芽孢杆菌W10的新的应用途径提供理论基础。