研究背景与目的流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis)是一种由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)感染引起的严重神经系统疾病,也是目前人类最常见的病毒性脑炎。尽管疫苗的使用极大地降低了其发病率,但是目前每年全世界仍报告接近七万JEV感染病例。这些病例大多分布在亚太区域,其中超过50%在我国河南和云贵川等地区。近年来,随着气候变化,人群迁移和病毒变异等原因,其发病率又有逐渐升高的趋势。由于临床上尚无特异性药物可用于治疗JEV感染引起的神经症状,导致该病病死率居高不下,幸存者中30%～50%会留下神经或精神后遗症,给公共卫生和社会带来了沉重的负担。因此,亟需深入探索JEV的致病机制,为开发有效抗病毒的药物提供坚实的理论依据。JEV是一种蚊媒传播的黄病毒,经蚊子叮咬人后首先引起局部感染,随后释放入血并穿越血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)感染神经元,造成中枢神经系统广泛炎症。其中,突破BBB是JEV发挥致病作用的关键步骤和重要前提,但是目前对于JEV穿越BBB的机制仍然知之甚少。脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMEC)作为BBB的主要成分,决定了BBB的结构和功能的完整性,也是阻止JEV穿越BBB的第一道防线。JEV感染BMEC是其发挥穿越BBB作用的初始事件。通过劫持内吞途径入侵(entry)细胞是病毒感染的首要步骤,涉及多种细胞过程和宿主蛋白。研究已经对JEV入侵多种类型宿主细胞的方式进行了表征,但目前对于JEV感染BMEC的入侵机制仍然不明确。在本课题中,通过干扰RNA文库系统筛选,我们鉴定出内吞途径相关分子caveolin-1和ezrin等宿主因子在JEV感染BMEC中的关键作用。在此基础上,我们将对JEV入侵BMEC所涉及的内吞途径和具体分子机制进行系统地研究。这不仅将加深对JEV穿越BBB机制的理解,还可以为抗JEV药物的开发提供重要的靶点。一、乙型脑炎病毒感染脑微血管内皮细胞的宿主因子筛选及内吞途径研究研究方法1.建立原代人脑微血管内皮细胞(human brain microvascular endothelial cell,HBMEC)单层模型,采用靶向人膜转运相关蛋白的干扰RNA文库系统筛选参与JEV感染的关键宿主因子。2.采用si RNA或化学抑制剂氯丙嗪抑制HBMEC中网格蛋白(clathrin)表达及功能,通过间接免疫荧光法和内吞(内化)实验分别检测对JEV的感染和入侵的影响。3.采用si RNA、化学抑制剂菲律平III或通过表达caveolin-1显性抑制突变体抑制小窝蛋白依赖的内吞途径,检测对JEV的感染和入侵的影响。4.对病毒和内吞途径标志性分子进行双重荧光标记,通过激光共聚焦技术分析JEV与clathrin和caveolin-1的定位关系。研究结果1.在接触培养48 h后,HBMEC呈单层极化生长,顶端面形成微绒毛结构,并高度表达内皮细胞标志分子血管性血友病因子和紧密连接蛋白Claudin-5。2.通过筛选,鉴定出18种宿主因子,这些因子的下调对JEV感染HBMEC的抑制率达到50%以上,包括:内吞途径标志分子CAV1(caveolin-1);转运所需内体分选复合物组成蛋白HGS和VPS4A;膜融合过程关键分子NSF和SYT1;肌动蛋白重组相关蛋白ACTR2、ACTR3、ARPC3、ARPC4、RAC1、EZR和WAS;内体和囊泡转运相关蛋白COPA、GAF1、RAB4B、RAB5A、RAB5B和RAB11B。3.绘制出校正的病毒入侵动力学曲线,显示0-6 h JEV内化(内吞)不断增加,到6 h达到最高。4.下调clathrin表达或抑制clathrin功能并不影响JEV在HBMEC中的感染率和内吞。5.下调caveolin-1表达或抑制caveolin-1功能,JEV在HBMEC中的感染率和内吞显著减少。6.JEV感染2 h时,病毒颗粒与caveolin-1在HBMEC膜皱褶处广泛共定位,而在细胞膜和胞内均不与clathrin共定位。结论JEV主要通过小窝蛋白介导的内吞途径入侵脑微血管内皮细胞,而不需要网格蛋白介导的内吞途径参与。同时,肌动蛋白细胞骨架重组,内体和囊泡转运,蛋白分选以及膜融合等过程在JEV对脑微血管内皮细胞的感染中也可能具有重要的作用。二、Ezrin在乙型脑炎病毒入侵脑微血管内皮细胞中的作用及机制研究方法1.利用si RNA分别敲低HBMEC中ERM成员蛋白moesin、ezrin和radixin,通过间接免疫荧光技术、吸附实验和内吞实验检测对JEV感染、结合和入侵的影响。2.利用ezrin特异性抑制剂NSC668394处理,通过检测病毒感染和入侵以及CT-B的内吞,分析ezrin参与JEV感染的阶段。3.采用鬼笔环肽染色检测JEV对肌动蛋白形态的影响;采用针对肌动蛋白重组的化学抑制剂处理后,检测JEV的感染与入侵,分析肌动蛋白重组在JEV感染和入侵中的作用。4.在NSC668394处理下,采用G/F-肌动蛋白比率测定实验结合病毒和细胞骨架共定位分析,检测JEV对肌动蛋白重组的影响以及ezrin在其中的作用。5.基于STRING数据库预测ezrin和caveolin-1共同相互作用蛋白,并通过si RNA和特异性抑制剂验证其中参与JEV入侵HBMEC的分子。6.利用抑制剂抑制Src(PP2)和ezrin或si RNA下调caveolin-1表达,通过免疫印迹法分析JEV对Src、ezrin和caveolin-1的活性状态的影响以及三者活化的上下游关系。7.利用免疫共沉淀技术结合重组蛋白体外激酶实验,分析JEV感染过程中Src、ezrin和caveolin-1的相互作用。8.在NSC668394处理下,通过磷酸化Src(p-Src)和磷酸化caveolin-1(p-caveolin-1)共定位分析,验证Src-caveolin-1相互作用以及ezrin在其中的作用。研究结果1.三种ERM蛋白中,仅ezrin下调后JEV的内化显著减少。2.NSC668394以剂量依耐性方式抑制JEV的感染,其预处理后对JEV内化的抑制率超过96%;NSC668394预处理后,HBMEC对CT-B的内吞也显著减少。3.JEV诱导HBMEC肌动蛋白广泛重组,抑制肌动蛋白重组时JEV在HBMEC中的感染率和内吞显著减少。4.NSC668394预处理后JEV诱导的肌动蛋白聚合以及病毒与细胞骨架的共定位明显减少。5.通过STRING数据库预测发现3个可能与ezrin和caveolin-1直接相关的分子,其中Src下调和抑制后JEV在HBMEC中的感染率和内吞显著减少。6.抑制Src后JEV诱导的ezrin和caveolin-1活化(磷酸化)均减少;抑制ezrin后caveolin-1活化减少而Src活化不受影响;下调caveolin-1后ezrin和Src的活化反而升高。7.针对Src、ezrin和caveolin-1的抗体均可以从JEV感染的HBMEC中沉淀出p-Src、p-ezrin和p-caveolin-1;在离体状态下,Src可以直接磷酸化ezrin和caveolin-1。8.JEV感染2 h后,p-Src与p-caveolin-1在细胞膜皱褶上发生明显共定位;NSC668394处理后p-caveolin-1及其与p-Src的共定位均明显减少。结论JEV可以通过激活Src/ezrin/caveolin-1通路并形成p-Src/p-ezrin/p-caveolin-1信号复合物的方式入侵HBMEC。Ezrin是Src介导caveolin-1活化进而促进JEV通过caveolin-1依赖的内吞途径入侵HBMEC的关键因素,也是JEV入侵中组织肌动蛋白重组的关键分子。三、靶向Src/ezrin的抑制剂作为潜在抗乙型脑炎病毒药物研究方法1.经皮下接种感染ICR乳鼠,通过观察症状、生存分析和苏木素伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色分析,确定建立JEV感染动物模型的实验条件。2.病毒感染后经皮下重复注射药物,通过生存分析,确定不同剂量NSC668394和PP2对JEV的致死性是否具有保护作用。3.病毒感染后经皮下重复给予高剂量的NSC668394(6 mg/kg)和PP2(7.5 mg/kg),采用RT-PCR法、间接免疫荧光法和HE染色检测小鼠脑组织JEV载量和病理损伤。研究结果1.经皮下注射4×10~3 PFU/只的JEV后,小鼠神经症状明显,死亡率为73.33%,并表现出典型的乙型脑炎病理改变。2.JEV感染后,经皮下重复注射6天高剂量的PP2(7.5 mg/kg)或NSC668394(6mg/kg),小鼠存活率分别提高到54.55%和61.91%。3.重复给予高剂量的PP2和NSC668394后,JEV感染小鼠的脑组织病毒载量均减少到模型组的1%左右,同时,脑组织病理损伤也显著改善。结论在JEV感染后重复给予PP2和NSC668394均可以明显减少脑组织病毒载量,缓解大脑病理损伤,挽救JEV感染导致的动物死亡。