研究背景随着干细胞移植技术的逐渐成熟，细胞治疗在神经系统疾病中的应用引起广泛关注。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是现如今应用较多的一类具有多向分化能力的成体干细胞，近年研究显示：从人羊膜中提取而来的羊膜间充质干细胞（Amniotic mesenchymal stem cells，AMSCs），由于其相对于胚胎干细胞和骨髓间充质干细胞，具有来源广泛、取材方便、易扩增、多向分化潜能以及免疫原性低等优点，同时又避开了胚胎干细胞来源缺乏、伦理道德和法律限制等问题，是目前细胞治疗的一种理想的种子细胞来源。越来越多的动物实验表明，移植羊膜间充质干细胞可以改善神经功能缺损症状，但具体作用机制尚需进一步探讨。小胶质细胞（microglia MI）是目前公认的对脑部损伤、炎性以及中枢神经系统退行性疾病进行反应的效应细胞，其主要特征是容易被任何形式的脑损伤或疾病所激活，在多种神经系统病变中发挥着损伤和修复的双重作用。活化的小胶质细胞在中枢神经系统的固有免疫反应中发挥着包括吞噬、免疫炎症反应、细胞毒性和通过抗原提呈T淋巴细胞的调节等作用。MI被激活后释放的多种细胞因子可引起不同程度的炎症反应和细胞凋亡，构成了“病理级联”效应。由此我们推测，在CNS早期的炎症或损伤过程中如果能调控MI的活化程度将对控制整个病理或损伤过程非常有利。CD200属于白细胞分化抗原,是一种细胞表面的跨膜糖蛋白,其表达范围较广，主要在神经细胞、胸腺细胞、B细胞T细胞、血管内皮细胞等。有研究表明CD200可以表达在羊膜间充质干细胞表面。CD200R与其配体CD200均属于免疫球蛋白超家族，CD200R主要表达在包括小胶质细胞在内的单核巨噬细胞系统和少量的T细胞上。CD200与CD200R通过细胞间接触,诱导免疫耐受,传递抑制性信号。研究发现,CD200能够下调中枢神经系统小胶质细胞的活化状态,使小胶质细胞诱导产生的细胞因子减少。由此我们设想羊膜间充质干细胞也有可能通过这种途径来调节中枢神经系统MI的活化，进而控制由其触发的一系列炎症级联反应的发生，从而发挥细胞治疗作用。目的本实验研究CD200-CD200R相关的细胞间接触途径,探索CD200在羊膜间充质干细胞对小胶质细胞免疫调节中的作用，以期更全面了解羊膜间充质干细胞的作用机制。第一部分羊膜间充质干细胞及小胶质细胞的体外培养及鉴定方法1.AMSCs的体外培养及鉴定，分别观察其原代培养和传代培养细胞生长情况并作出生长曲线；AMSCs的体外诱导分化实验2.MI的体外培养、纯化及鉴定3.MI的活化结果1.成功由羊膜组织分离、培养得到的AMSCs具有MSCs的形态和细胞表面标志，符合MSCs的生长、增殖特点，流式细胞仪检测显示该细胞表达CD73、CDl05，不表达CD45和HLA-DR。AMSCs诱导前不表达NSE，弱表达GFAP，经诱导后细胞强表达神经细胞特异性标记物NSE、GFAP。2.成功分离、纯化的MI形态上细胞体呈细长或椭圆,从胞体发出细小而有分支的突起。CD68免疫荧光染色阳性的细胞达到细胞总数的95%以上，MI纯度较高。3.MI经LPS刺激后活化，细胞呈阿米巴样外观，MAC-1免疫荧光阳性，静息状态的MI自身能分泌微量的TNF-α和IL-6，激活后上清液中炎性因子的含量明显升高，激活前后差异具有统计学意义（P<0.05）。第二部分羊膜间充质干细胞体外调控小胶质细胞活性及其可能机制研究方法1.免疫荧光染色法检测AMSCs表面CD200的表达；ELISA检测P2-P6AMSCs上CD200的表达。2.免疫荧光染色法检测MI表面CD200R的表达；ELISA检测P1-P4MI上CD200R的表达。3.AMSCs与MI体外共培养及抗CD200抗体阻断实验。建立AMSCs和MI共培养体系，实验分组如下：MI组、MI+LPS组、MI+LPS+AMSCs组、MI+LPS+AMSCs+抗CD200抗体组、MI+LPS+AMSCs transwell组,共培养48h后观察各组细胞的形态;ELISA检测各组上清中炎性因子TNF-α和IL-6的表达,免疫荧光法、ELISA检测各组细胞表面CD200R的表达。结果1.AMSCs表达CD200，且P2-P6CD200的表达呈递增趋势,至P6表达增加明显,P2与P6差异有统计学意义(P＜0.0001)。2.MI表达CD200R，CD200R在各代MI表面均有表达，与P1相比，其余各代OD值均升高，但各代间相比无显著差异（P＞0.05）。3.在LPS作用下上清液中TNF-α和IL-6的分泌量较MI组显著增加，而在LPS+MI+AMSCs组中，当有AMSCs存在时，两种炎性因子的分泌量呈明显下降趋势，LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗体组培养48h后，两种细胞因子分泌量较LPS+MI+AMSCs组上升，但仍低于LPS+MI组；Transwell组两种细胞因子分泌量较LPS+MI+AMSCs组明显升高，与LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗体组比较无明显差异。4.免疫荧光法可见每组均有CD200R阳性细胞，MI+LPS组较MI组荧光强度稍减弱，MI+LPS+AMSCs组CD200R比MI+LPS组明显增强，抗CD200抗体组、Transwell组较MI+LPS组无明显差异。5.MI+LPS组CD200R的表达较MI组有所减少，当有AMSCs存在时，CD200R的表达呈显著上升趋势，LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗体组培养48h后，CD200R的表达较LPS+MI+AMSCs组下降，但与LPS+MI组比较无明显差异，Transwell组CD200R的表达较LPS+MI+AMSCs组明显降低，与LPS+MI+AMSCs+抗CD200抗体组比较差异不明显。统计学方法所有统计分析均用SPSS16.0统计软件分析。数据均采用均数±标准差(x±s)表示，两组间比较采用T检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)，P<0.05表示差异具有统计学意义。结论1.AMSCs表面表达CD200，MI表面表达CD200R。2.AMSCs与MI共培养可使活化MI表面CD200R的表达上调，通过CD200-CD200R的直接接触对活化的MI发挥免疫抑制作用，调节MI的活化程度，减少炎性细胞因子分泌,抗CD200抗体能够逆转这种抑制作用。