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西藏灵菇(Tibetan Kefir)，又称藏灵菇、雪莲菌，类似于kefir粒。研究表明西藏灵菇是由乳酸菌、酵母菌和醋酸菌等微生物在多糖的环境中，经过长期相互适应与协同作用形成的非常复杂的多菌种共生体系，通常以颗粒状存在。大量实践与研究证明，西藏灵菇发酵乳具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化、对胃肠道进行保护、降脂、抑菌等功能，推测多糖是其中的主要活性成分。目前，对西藏灵菇的研究主要集中于西藏灵菇的菌相组成分析、西藏灵菇发酵乳的功能活性和西藏灵菇菌粒形成的原因等方面，关于西藏灵菇菌粒中产胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)乳酸菌的EPS的结构及功能和西藏灵菇发酵乳产品开发的研究较少。
本文对西藏灵菇中优势菌的组成进行分析并筛选出产EPS的乳酸菌，继而对产EPS乳酸菌的EPS进行分离纯化和结构解析，之后将EPS作为益生元研究其对肠道的益生功能，最后将西藏灵菇菌粒和产EPS乳酸菌作为发酵剂发酵纯牛奶制得发酵乳，并对发酵乳在储藏期内的微生物、物理和化学变化进行测定，从而为西藏灵菇菌粒的形成机理提供一定的理论依据，为西藏灵菇发酵乳产品的开发与应用提供参考。研究内容和结果如下:
(1)分别用乳酸菌、酵母菌和醋酸菌鉴别培养基对西藏灵菇菌粒与发酵乳中的微生物菌种进行分离纯化，共得到8株菌种;经形态学观察和分子生物学鉴定，其中4株为乳酸菌，2株为酵母菌，2株为醋酸菌;4株乳酸菌分别为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)(LZ-R-5)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)(LZ-R-12)、戊糖乳杆菌(L.pentosus)(L-Z-R-17)和果糖杆菌(FructobaciHus durmns)(LZ-R-20)，2株酵母菌分别为马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxians)(LZ-JM-1)、毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)(LZ-JM-3)，2株醋酸菌为可可豆醋杆菌(Acetobacter fabarum)(LZ-C-1)、东方醋酸菌(A.orientalis)(LZ-C-3)。将这8株菌置于纯牛奶中发酵(接种量为4％,发酵温度为37℃，发酵时间24h)，结果显示LZ-R-5和LZ-R-17分泌较多r-EPS，LZ-R-12、LZ-JM-1和LZ-JM-3分泌少量r-EPS，LZ-C-1和LZ-C-3几乎不分泌r-EPS;LZ-R-17的r-EPS产量最大，为185.2mg/L。荚膜染色实验表明，三株产r-EPS的乳酸菌均能产生C-EPS，其中c-EPS产量从大到小为:LZ-R-17＞LZ-R-5＞LZ-R-5;LZ-R-17的c-EPS产量为32.5mg/L;但由于c-EPS紧密结合在菌体表面，较难提取，其实际含量应该远远大于测定值。
(2)通过UV、单糖组成、NMR和FT-IR等实验，发现LZ-R-5的EPS分级纯化得到的三个组分EPS-1、EPS-2和EPS-3的一级结构相同，LZ-R-17的EPS分级纯化得到的三个组分EPS-1、EPS-2和EPS-3的一级结构也相同;基本可以确定LZ-R-5的EPS的三个组分为同一种多糖，LZ-R-17的EPS的三个组分为同一种多糖。LZ-R-5和LZ-R-17在纯牛奶中37℃恒温条件下静置发酵，得到最大粗EPS产量分别为128mg/L和186mg/mL。多糖常规组成成分分析结果显示，LZ-R-5和LZ-R-17的粗EPS中含有少量蛋白质，EPS-1、EPS-2和EPS-3中也含有极少量蛋白质;LZ-R-5和LZ-R-17的EPS-1中均不合糖醛酸和硫酸基，EPS-2和EPS-3中含有极少量硫酸基而不合糖醛酸。采用高效液相色谱法多粗EPS分级纯化后的组分进行纯度和相对分子量的鉴定，结果证实，LZ-R-5和LZ-R-17的EPS-1和EPS-2两个组分都得到均一对称的峰形，说明其纯度很高;LZ-R-5和LZ-R-17的EPS-3有少量杂峰。根据标曲计算可知LZ-R-5的EPS相对分子量在5.73×105～5.41×105Da间;LZ-R-5的EPS相对分子量在1.13×106～1.20×106Da间。
(3)LZ-R-5和LZ-R-17的EPS主要为中性多糖，两者单糖组成均为葡萄糖和半乳糖，LZ-R-5的EPS葡萄糖和半乳糖的摩尔比约为3.66:1，LZ-R-17的EPS葡萄糖和半乳糖的摩尔约比为3.16:1;LZ.R-5的EPS为线性杂多糖，其可能结构式为:
→[-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→]n
扫描电镜图显示LZ-R-5和LZ-R-17的EPS-1表面微观形态结构比较相似，表面光滑呈薄片状聚集，存在一些大小不一不规则的空洞，多糖之间或以丝状或以片状连接;只是片段厚度、空洞数量、皱缩程度有些差异。刚果红实验结果表明LZ-R-5的EPS-1可能含有三股螺旋结构，LZ-R-17的EPS-1不含三股螺旋结构。
(4)利用体外粪样混合厌氧发酵方法对不同结构类型多糖纯品的益生功能进行研究。利用荧光原位杂交(FISH)法比较了发酵前后体系内有益菌、有害菌及总菌群的变化情况，通过HPLC测定发酵过程中各种短链脂肪酸(SCFAs)种类和含量的变化:可以得出LZ-R-5和LZ-R-17的EPS均具有显著的促有益菌增殖的作用，拥有较高的选择}生指数(SI)，且在发酵过程中产生乙酸和乳酸较多，呈现出良好的益生活性。
(5)以西藏灵菇菌粒和前期试验从西藏灵菇中分离得到的产胞外多糖乳酸菌作为发酵剂发酵纯牛奶得到五种发酵乳，以CX为对照，通过一系列指标测定五种发酵乳在4℃的冷藏温度下储藏28天的微生物和理化变化。结果表明五种发酵乳储藏过程中pH持续下降，酸度持续升高;LZ-R-5、LZ-R-17和HJ中乳酸菌活菌数呈现一直减少的趋势，LZ-R-12和XZLG中乳酸菌活菌数呈现先增多后减少的趋势，到第28d，五种发酵乳乳酸菌活菌数均大于1×107CFU/g;整个保藏期间大肠杆菌、霉菌均未检出;随着储藏时间的延长，五种发酵乳持水力呈现先增大后减小的趋势，五种发酵乳储藏过程中的最大持水力按从大到小的顺序分别为:LZ-R-17(88.30％)、LZ-R-5(84.59％)、HJ(67.31％)、CX(65.28％)、LZ-R-12(58.31％)和XZLG(57.07％);随着储藏时间的延长，五种发酵乳表观粘度呈现先增大后减小的趋势，五种发酵乳的表观粘度整体大小比较与持水力一致;比较五种发酵乳最大G和G"值，比较弹性模量(G)可知，LZ-R-17＞LZ-R-5＞HJ＞CX＞LZ-R-12＞XZLG，五种发酵乳的粘性模量(G")差异相对G而言不显著;五种发酵乳中，LZ-R-17和LZ-R-5总体上的感官表现最好，在储藏第4d的5个指标总得分最高。综合分析可知，五种发酵乳的最佳食用时间是第4天，此时发酵乳有最佳感官体验;五种发酵乳在4℃条件下的保质期定为21天是比较合适的。
(6)通过五种发酵乳在不同储藏天数的比较分析，发现发酵乳EPS含量与发酵乳持水力、水分分布、表观黏度、G7之间存在高度相关性:发酵乳EPS含量增多，其持水力增大，T22降低，表观粘度增大，G7增大;发酵乳EPS含量减少，其持水力减小，T22升高，表观粘度减小，G7减小。说明发酵乳粘性EPS的产生有助于提高其持水力、表观粘度、粘弹性，改善其质地等，因而对发酵乳品质产生积极影响(注:本文中提到的EPS如无说明均为r-EPS)。
本文对西藏灵菇中优势菌的组成进行分析并筛选出产EPS的乳酸菌，继而对产EPS乳酸菌的EPS进行分离纯化和结构解析，之后将EPS作为益生元研究其对肠道的益生功能，最后将西藏灵菇菌粒和产EPS乳酸菌作为发酵剂发酵纯牛奶制得发酵乳，并对发酵乳在储藏期内的微生物、物理和化学变化进行测定，从而为西藏灵菇菌粒的形成机理提供一定的理论依据，为西藏灵菇发酵乳产品的开发与应用提供参考。研究内容和结果如下:
(1)分别用乳酸菌、酵母菌和醋酸菌鉴别培养基对西藏灵菇菌粒与发酵乳中的微生物菌种进行分离纯化，共得到8株菌种;经形态学观察和分子生物学鉴定，其中4株为乳酸菌，2株为酵母菌，2株为醋酸菌;4株乳酸菌分别为瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)(LZ-R-5)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp.Lactis)(LZ-R-12)、戊糖乳杆菌(L.pentosus)(L-Z-R-17)和果糖杆菌(FructobaciHus durmns)(LZ-R-20)，2株酵母菌分别为马克思克鲁维酵母菌(Kluyveromyces marxians)(LZ-JM-1)、毕赤酵母菌(Pichia kudriavzevii)(LZ-JM-3)，2株醋酸菌为可可豆醋杆菌(Acetobacter fabarum)(LZ-C-1)、东方醋酸菌(A.orientalis)(LZ-C-3)。将这8株菌置于纯牛奶中发酵(接种量为4％,发酵温度为37℃，发酵时间24h)，结果显示LZ-R-5和LZ-R-17分泌较多r-EPS，LZ-R-12、LZ-JM-1和LZ-JM-3分泌少量r-EPS，LZ-C-1和LZ-C-3几乎不分泌r-EPS;LZ-R-17的r-EPS产量最大，为185.2mg/L。荚膜染色实验表明，三株产r-EPS的乳酸菌均能产生C-EPS，其中c-EPS产量从大到小为:LZ-R-17＞LZ-R-5＞LZ-R-5;LZ-R-17的c-EPS产量为32.5mg/L;但由于c-EPS紧密结合在菌体表面，较难提取，其实际含量应该远远大于测定值。
(2)通过UV、单糖组成、NMR和FT-IR等实验，发现LZ-R-5的EPS分级纯化得到的三个组分EPS-1、EPS-2和EPS-3的一级结构相同，LZ-R-17的EPS分级纯化得到的三个组分EPS-1、EPS-2和EPS-3的一级结构也相同;基本可以确定LZ-R-5的EPS的三个组分为同一种多糖，LZ-R-17的EPS的三个组分为同一种多糖。LZ-R-5和LZ-R-17在纯牛奶中37℃恒温条件下静置发酵，得到最大粗EPS产量分别为128mg/L和186mg/mL。多糖常规组成成分分析结果显示，LZ-R-5和LZ-R-17的粗EPS中含有少量蛋白质，EPS-1、EPS-2和EPS-3中也含有极少量蛋白质;LZ-R-5和LZ-R-17的EPS-1中均不合糖醛酸和硫酸基，EPS-2和EPS-3中含有极少量硫酸基而不合糖醛酸。采用高效液相色谱法多粗EPS分级纯化后的组分进行纯度和相对分子量的鉴定，结果证实，LZ-R-5和LZ-R-17的EPS-1和EPS-2两个组分都得到均一对称的峰形，说明其纯度很高;LZ-R-5和LZ-R-17的EPS-3有少量杂峰。根据标曲计算可知LZ-R-5的EPS相对分子量在5.73×105～5.41×105Da间;LZ-R-5的EPS相对分子量在1.13×106～1.20×106Da间。
(3)LZ-R-5和LZ-R-17的EPS主要为中性多糖，两者单糖组成均为葡萄糖和半乳糖，LZ-R-5的EPS葡萄糖和半乳糖的摩尔比约为3.66:1，LZ-R-17的EPS葡萄糖和半乳糖的摩尔约比为3.16:1;LZ.R-5的EPS为线性杂多糖，其可能结构式为:
→[-β-D-Galp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→]n
扫描电镜图显示LZ-R-5和LZ-R-17的EPS-1表面微观形态结构比较相似，表面光滑呈薄片状聚集，存在一些大小不一不规则的空洞，多糖之间或以丝状或以片状连接;只是片段厚度、空洞数量、皱缩程度有些差异。刚果红实验结果表明LZ-R-5的EPS-1可能含有三股螺旋结构，LZ-R-17的EPS-1不含三股螺旋结构。
(4)利用体外粪样混合厌氧发酵方法对不同结构类型多糖纯品的益生功能进行研究。利用荧光原位杂交(FISH)法比较了发酵前后体系内有益菌、有害菌及总菌群的变化情况，通过HPLC测定发酵过程中各种短链脂肪酸(SCFAs)种类和含量的变化:可以得出LZ-R-5和LZ-R-17的EPS均具有显著的促有益菌增殖的作用，拥有较高的选择}生指数(SI)，且在发酵过程中产生乙酸和乳酸较多，呈现出良好的益生活性。
(5)以西藏灵菇菌粒和前期试验从西藏灵菇中分离得到的产胞外多糖乳酸菌作为发酵剂发酵纯牛奶得到五种发酵乳，以CX为对照，通过一系列指标测定五种发酵乳在4℃的冷藏温度下储藏28天的微生物和理化变化。结果表明五种发酵乳储藏过程中pH持续下降，酸度持续升高;LZ-R-5、LZ-R-17和HJ中乳酸菌活菌数呈现一直减少的趋势，LZ-R-12和XZLG中乳酸菌活菌数呈现先增多后减少的趋势，到第28d，五种发酵乳乳酸菌活菌数均大于1×107CFU/g;整个保藏期间大肠杆菌、霉菌均未检出;随着储藏时间的延长，五种发酵乳持水力呈现先增大后减小的趋势，五种发酵乳储藏过程中的最大持水力按从大到小的顺序分别为:LZ-R-17(88.30％)、LZ-R-5(84.59％)、HJ(67.31％)、CX(65.28％)、LZ-R-12(58.31％)和XZLG(57.07％);随着储藏时间的延长，五种发酵乳表观粘度呈现先增大后减小的趋势，五种发酵乳的表观粘度整体大小比较与持水力一致;比较五种发酵乳最大G和G"值，比较弹性模量(G)可知，LZ-R-17＞LZ-R-5＞HJ＞CX＞LZ-R-12＞XZLG，五种发酵乳的粘性模量(G")差异相对G而言不显著;五种发酵乳中，LZ-R-17和LZ-R-5总体上的感官表现最好，在储藏第4d的5个指标总得分最高。综合分析可知，五种发酵乳的最佳食用时间是第4天，此时发酵乳有最佳感官体验;五种发酵乳在4℃条件下的保质期定为21天是比较合适的。
(6)通过五种发酵乳在不同储藏天数的比较分析，发现发酵乳EPS含量与发酵乳持水力、水分分布、表观黏度、G7之间存在高度相关性:发酵乳EPS含量增多，其持水力增大，T22降低，表观粘度增大，G7增大;发酵乳EPS含量减少，其持水力减小，T22升高，表观粘度减小，G7减小。说明发酵乳粘性EPS的产生有助于提高其持水力、表观粘度、粘弹性，改善其质地等，因而对发酵乳品质产生积极影响(注:本文中提到的EPS如无说明均为r-EPS)。