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随着组织工程的发展，重建皮肤逐渐成为解决大面积烧伤自体皮源不足这一难题的途径之一。国内外的许多研究者致力于寻找合适的种子细胞与具备一定皮肤组织结构的真皮支架构建组织工程皮肤进行复合移植，用于治疗全层皮肤缺损和深度烧伤。
本课题组于2000年开始系统研究组织工程皮肤的构建，成功地分离出皮肤源祖细胞，构建血浆真皮再生模板，并将皮肤源祖细胞复合血浆真皮再生模板构建人工皮肤；构建皮肤源祖细胞一透明质酸复合物应用于糖尿病大鼠的皮肤缺损创面的修复，取得了一定成果。组织工程皮肤种子细胞的研究应进一步深入，并且要解决以下问题：①提高种子细胞的增殖活性；②种子细胞的安全性；③种子细胞修复创面的机制。
成纤维细胞生长因子结合蛋白(FGF-BP)是近年来发现的FGF家族的载体蛋白，尤其对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)作用明显。FGF-BP通过激活FGF，使其参与胚胎发育、细胞增殖分裂、创面修复及肿瘤生长等生理病理过程。FGF-BP在FGF正常发挥生物学活性的过程中起着重要作用，并被称为肿瘤形成的“限速者”和血管形成的“开关”。
因此，本课题通过在细胞培养过程中引入FGF-BP，观察其对皮肤源祖细胞体外增殖，安全性的影响；观察其对皮肤源祖细胞体内动员、迁移以修复创面的作用。
第一部分：皮肤源祖细胞的培养与鉴定
目的：分离、纯化皮肤源祖细胞，观察其体外培养细胞的生物学特性，为创面修复的细胞治疗提供理想的细胞源。
方法：取出生1～3天的昆明乳鼠的皮肤，消化分离皮肤源祖细胞，在含表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的无血清培养基中培养、传代，观察细胞生长状态；检测细胞周期；分别用免疫荧光方法和流式细胞仪方法检测细胞胞内抗原Fibronectin、Nestin、GFAP和NSE及细胞表面标记物CD29、CD71、CD34、CD49f的表达。
结果：细胞悬浮生长，形成克隆球团；细胞纯化后的细胞周期G0／G1为(90.433±1.504)％；细胞免疫荧光显示细胞表达Nestin和Fibronectin阳性；流式细胞仪检测Nestin表达占(4.44±0.233)％，Fibronectin表达占(8.44±0.564)％，GFAP表达占(4.0±0.350)％，NSE表达占(51.5±0.278)％；细胞表面标记物CD29强阳性，占(98.9±0.361)％，CD34阳性，占(87.567±1.341)％，CD49f与CD71弱阳性，分别为(4.233±0.874)％，(39.8±1.136)％。
结论：所培养的细胞为皮肤源祖细胞，它处于相对静止状态，具有高度的分化潜能和很强的增殖能力。
第二部分：成纤维细胞生长因子结合蛋白对皮肤源祖细胞体外增殖和端粒酶活性的影响
目的：在皮肤源祖细胞培养过程中，加入FGF-BP这一干预因素，观察其对细胞增殖性及安全性的影响。
方法：为了探讨FGF-BP对细胞增殖的影响，将已纯化的皮肤源祖细胞进行分组，分别在培养基中加入0、0.01、0.1、1、10、100、1000ng／ml梯度浓度的FGF-BP，用CCK-8试剂盒筛选FGF-BP对皮肤源祖细胞的最大作用浓度；以有无加入FGF-BP最大作用浓度培养细胞分为FG：F-BP(+)和FGF-BP(-)两组，进行绘制生长曲线、端粒酶活性测定、染色体核型分析及细胞胞内、表面标记物测定，比较两组之间的差异；观察两组细胞成脂诱导差异。
结果：在含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的培养基中加入10ng／ml的FGF-BP对细胞增殖的作用最大。FGF-BP对于皮肤源祖细胞的作用呈双向性，在0～10ng／ml浓度区间FGF-BP与皮肤源祖细胞增殖之间呈剂量依赖关系，在10～1000ng／ml浓度区间随FGF-BP浓度增加，皮肤源祖细胞的增殖活性降低；FGF-BP(+)组细胞生长增殖速度快于FGF-BP(-)组；FGF-BP(+)组细胞端粒酶活性下降速度慢于FGF-BP(-)组，P<0.05；细胞周期测定FGF-BP(+)细胞G0／G1所占百分比为(80.400±0.656)％；FGF-BP(-)细胞G0/G1所占百分比为(81.967±0.208)％，两组细胞之间没有统计学差异；两组细胞正常二倍体核型，细胞染色体数目和结构正常，未见缺失、易位、断裂等畸形；FGF-BP(+)组细胞胞内抗原Fibronectin表达占(2.5±0.259)％，Nestin表达占(1.7±0.388)％，GFAP表达占(1.5±0.908)％，NSE表达占(17.4±0.290)％；FGF-BP(-)组细胞胞内抗原Fibronectin表达占(3.4±0.318)％，Nestin表达占(1.5±0.616)％，GFAP表达占(1.0±0.369)％，NSE表达占(16.3±0.260)％；皮肤源祖细胞克隆球团细胞表面分子表达，FGF-BP(+)细胞CD29占(81.6±0.216)％，CD71占(93.2±0.233)％，CD49f占(30.1±0.565)％，CD34为(90.3±0.282)％；FGF-BP(-)细胞CD29占(72.6±0.213)％，CD71占(91.0±0.239)％，CD49f占(34.4±0.1 90)％，CD34为(92.3±0.284)％，两组之间没有统计学差异(P>0.05)；两组细胞成脂诱导后油红0染色均为阳性。
结论：在细胞培养基中引入FGF-BP，提高了碱性成纤维细胞生长因子促皮肤源祖细胞增殖的作用；FGF-BP在调节细胞增殖过程中起双向作用；延缓了皮肤源祖细胞端粒酶活性的降低速度，但未见影响皮肤源祖细胞的细胞周期、染色体核型及多向分化潜能，为皮肤源祖细胞进行体内实验研究提供安全方面的理论依据。
第三部分：FGF-BP对皮肤源祖细胞修复创面及体内归巢的作用
目的：探讨皮肤源祖细胞在创面愈合过程中的归巢功能及FGF-BP在细胞归巢和创面愈合中所起的作用。
方法：40只昆明鼠随机分为FGF-BP(+)组(A组)、FGF-BP(-)组(B组)、对照组(C组)和未处理组(D组)，对前三组细胞昆明鼠背部制作1个直径大小为1.0cm的圆形全层皮肤缺损创面，A、B、D组分别尾静脉缓慢注射用CM—DiI标记过的皮肤源祖细胞悬液0.1ml，C组尾静脉注射等量生理盐水；A组创缘微量注射FGF-BP(10ng／ml，0.5ml)，B、C组分别在创缘注射等量生理盐水。观察A、B、C组创面收缩率、组织形态学、微血管的改变；观察A、B、D组皮肤源祖细胞体内动员迁移情况；将FGF-BP(+)、FGF-BP(-)两组细胞接种于裸鼠皮下进行成瘤性实验。
结果：各组1w、2w时创面收缩明显，渗液少，创缘可见新生上皮长出，两细胞移植组表皮层略厚于对照组；1w、2w时A组与B组创面收缩率显著高于对照组(P<0.05)，1w、2w时A组创面收缩率亦明显高于B组(P<0.05)；1w、2w时A组与B组创面微血管形成数目显著高于对照组(P<0.05)；1w时A组创面微血管数目明显高于B组，而2w时，两组之间差异不明显，微血管数目相近(P>0.05)；移植1w后，冰冻切片可见在背部创面处及其周边部位出现CM-Dil标记皮肤源祖细胞，在该组小鼠远离创面的正常皮肤和D组小鼠皮肤CM-Dil标记的移植细胞较少。A组可见细胞迁移至皮肤全层，包括毛囊乳头处，CM-Dil标记的移植细胞密度为41.75±3.594个／mm2，与B、D组比较有统计学意义(P<0.05)；2w时标记的移植细胞密度为141±7.616个／mm2，与B、D组比较有统计学意义(P<0.05)。此外，移植细胞还分布于各组小鼠肺脏、脊髓和肝脏，但脾、肾、心肌、脑未见移植细胞；裸鼠成瘤性实验示注射局部无红肿、包块，病理组织检查未发现细胞和组织异常。
结论：FGF-BP“开启”了bFGF发挥生物学作用的“开关”，介导皮肤源祖细胞体内归巢，促使创面愈合及血管的再生；在加入FGF-BP的培养体系中，皮肤源祖细胞体内实验中未出现恶性转化。