前言 心肌缺血再灌注损伤是体外循环手术、冠脉搭桥手术、冠脉扩张和溶栓手术等临床实践中常见的组织器官损伤。其发生的病理机制一直是多年来的研究热点课题，尽管已经提出相关机制学说，如氧自由基学说、钙超载学说等，但其准确机制仍不十分清楚。肿瘤坏死因子(TNF)是一种自分泌的促炎症细胞因子，在缺血再灌注损伤、脓毒血症、慢性心功能不全、病毒性心肌炎以及心脏同种移植排斥反应中导致心肌机能障碍和心肌细胞坏死。TNF有二种形式，TNF-α与TNF-β，由于TNF-α与缺血再灌注损伤有密切的相关性，因此，本研究中TNF指的是TNF-α。 近年来，TNF与缺血再灌注损伤的关系以及抗TNF治疗日益受到重视，但TNF在心肌缺血再灌注损伤中的准确作用机制尚不十分明确，本研究采用大鼠离体缺血再灌注心脏模型，通过检测心肌组织中的TNF含量、心肌细胞中TNF mRNA和蛋白表达、Fas／Fas-L mRNA和蛋白表达的变化，并采用TUNEL和电镜技术检测心肌细胞凋亡情况等，来进一步探讨TNF在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制。同时，在实验过程中应用抗氧化剂黄芪，观察其对TNF变化的影响。为运用正确的适当的抗TNF治疗来防止心肌缺血再灌注损伤提供新的思路与重要的理论基础。 实验材料 1．实验动物 雄性成熟Wistar大鼠，体重250-300g，共34只。中国医科大学第二临床学院动物室提供。 2．主要仪器 Olymus BC60光学显微镜(台湾)，TECAN SUNRISE型(奥地利)酶标仪，法国500-P紫外光可见光连续分光光度计，美国PTC-100PCR扩增仪，Kodak ID型凝胶成像系统分析仪，PhiliPs CM10透射电镜。 3．主要试剂 免疫组化试剂盒购自北京中山生物工程公司；原位杂交试剂盒购自武汉博土德生物工程有限公司；PCR检测试剂盒购自 TaKaRa公司；引物由北京奥科生物工程公司提供；TNF酶联免疫试剂盒由美国R＆D Systems Inc公司提供；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；黄色注射液由上海福达制药有限公司生产，批号：010403，浓度为 Zg／nd生药。 实验方法 二．离体心脏的制备 腹腔注射20％乌拉坦广ykg）麻醉，腹腔注射肝素钠500U抗凝。纵劈胸骨人路迅速取出心脏，并立即浸人4℃冷生理盐水中，经主动脉插管后，连接于自制ungen加ar离体，已脏灌注模型装置上，以叨℃xu液灌注，灌注压恒定为70mmHg门．31kPa，95cmHp人将34只实验动物随机分成三组。对照组、实验组和黄茂组。 经15min的自然灌流平衡后，实验组，经主动脉根部灌注 Thomas心脏停搏液，在 37℃以 70rnmHg的灌注压连续灌注 Zmin；黄色组，Thomas液中加人黄菌注射液门，ZInl／kgL这两组心脏经常温下（37）缺血30min后，以37℃KH液再灌注。实验组和黄茂组分别于缺血30min后、再灌注30在0J 四个时点取材，每个时点3例。对照组，不经历缺血与再灌注，只用37℃KH液连续有氧灌注，心肌温度保持在37℃，在与上两组相对应的时点取材以做正常对照。 2．标本的收集与处理 实验结束后，取部分左心室心肌立即放人4℃，4％多聚甲醛（含0．l％DEPC溶液）中，固定12－20 ／J’时后，送病理室制作切片；另取部分左心室心肌标本 （ mm’左右X立即放人 3．l％戊二醛溶液中，固定 24小时后送电镜室制作切片；再取部分左心室心肌放人 0．l％DEPC处理后储存管中，于液氮中保存，后移人一70℃冰箱中保存。 3．检测指标及方法 采用酶联免疫、免疫组化、原位杂交JUNEL法、透射电镜和 RT－PCR等方法检测心肌组织中TNF、Fas／Fas－L表达及细胞凋亡发生情况。 ·2· 4．统计学方法 所有数据均以 k。s表示，用 SPSS软件进行 t检验，p＜0．05认为有显著性差异。 去 果 二．酶联免疫法测定TNF结果 在无缺血再灌注的对照组心肌组织中可以检测到一定含量的TNF，但是，在经历缺血再灌注的实验组，心肌组织中的TNF水平较对照组明显升高h＜0．05＊然而，在缺血前使用黄色的心肌组织中 TNF水平，虽比对照组有增高（再灌注 60＊ min两时点，P＜0．05X但与实验组相比则明显降低（P＜0．05）。 2．免疫组织化学测定结果 在对照组心肌组织中没有TNF＊as爪as－L蛋白表达，免疫组化染色呈阴性；实验组心肌组织中的TNF yas／Fas－L蛋白表达增多，并且可见TNF在再灌注30min时，染色最强，随时间延长表达逐渐减弱，Fas／Fas－L随时间延长表达增强，在再灌注12Olll。时，表达最强，免疫组化染色呈强阳性或极强阳性；然而，在缺血前使用黄茂的心肌组织中，TNF、Fas／Fas－L免疫组化染色呈阳性或强阳性，较实验组染色明显降低。 3．原位杂交检测结果 在对照组心肌组织中没有TPW mRNA表达，染色呈阴性；实验组心肌组织中的TNF mRNA表达明显，染色呈强阳性或极强阳性，并且可见呈阳性表达的细胞是心肌细胞，本研究未发现有其他细胞呈阳性表达；在