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植物细菌性病害严重威胁着全球农业生产。水稻白叶枯病（BLB）和水稻细菌性条斑病（BLS）是由Xanthomonas oryzae pv.oryzae（Xoo）和Xanthomonas oryzae pv.oryzicola（Xoc）引起的两种重要水稻细菌性病害,会严重影响水稻的产量和品质。长期使用叶枯唑、噻唑锌和噻菌铜等传统杀菌剂会导致病原体产生耐药性,并对环境和植物的安全产生一定的副作用。从天然产物中提取的抗菌剂通常比合成化学品具有更大的优势,包括对哺乳动物毒性低、易分解、环境友好。因此,微生物农药是近年来研究的热点。在本工作中,从来自金钗石斛的内生细菌多粘类芽孢杆菌Y-1发酵液中提取了多种活性代谢物。通过~1H NMR、13C NMR和高分辨率质谱对其结构进行了鉴定。在体外首次发现活性代谢物具有抗Xoo和抗Xoc活性。此外,还在体内首次发现活性代谢物对BLB和BLS具有出色的保护活性。抗菌机制表明,活性代谢物多粘菌素B1可以激活苯丙烷生物合成途径,诱导植物表达防御相关蛋白。同时,还可以提高防御酶活性,促进木质素合成,增强水稻对病原菌的抗性。这些结果表明,生物源农药作为一种潜在的抗菌剂,具有广阔的应用前景。本研究尝试探索多粘类芽孢杆菌Y-1活性代谢物的抗植物细菌性病害的活性情况,研究开展的具体过程与内容如下:1.采用单因素实验为多粘类芽孢杆菌Y-1选择碳源、氮源、浓度、温度、pH值和时间,研究它们对多粘类芽孢杆菌Y-1发酵液抑菌能力的影响。以10 g/L蛋白胨、0.4 g/L Mg SO4和2 g/L KH2PO4为基础培养基（pH=7）,分别添加30 g/L乳糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、甘油和淀粉碳源,制备不同碳源的培养基（200 m L）,然后接种多粘类芽孢杆菌Y-1（10 m L）。以20 g/L甘油、0.4 g/L Mg SO4和2 g/L KH2PO4为基础培养基（pH=7）,分别添加10 g/L蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉和尿素氮源,制备不同氮源的培养基（200 m L）,然后接种多粘类芽孢杆菌Y-1（10 m L）。以0.4 g/L Mg SO4和2 g/L KH2PO4为基础培养基（pH=7）,分别添加碳源和氮源,制备浓度分别为50 g/L、40 g/L、30 g/L、20 g/L和10 g/L的营养培养基（200 m L）,然后接种多粘类芽孢杆菌Y-1（10m L）。pH值的影响表明,在基础培养基（200 m L）中加入1 mol/L HCl和Na OH,将pH值调节至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0,然后接种多粘类芽孢杆菌Y-1菌株（10 m L）。温度效应表明,多粘类芽孢杆菌Y-1分别在25°C、26°C、27°C、28°C、29°C和30°C的振动台上培养。时间效应表明,多粘类芽孢杆菌Y-1分别在摇瓶中培养48、72、96、120、144、168、192和216小时。采用纸片法检测多粘菌Y-1发酵液对Xoo和Xoc的抗菌活性。2.采用活性示踪法从多粘类芽孢杆菌Y-1发酵液中提取活性代谢物。将多粘类芽孢杆菌Y-1发酵液在8000 rpm条件下离心30 min,然后过0.5 nm滤膜,得上清液,将上清液置于Amberlite XAD–16柱上,用水-甲醇洗脱,洗脱液极性逐渐降低,纯水与甲醇的比例依次为100:0（A）、75:25（B）、50:50（C）、20:80（D）、0:100（E）。然后利用Amberlite XAD–16大孔吸附树脂、反向层析树脂（SKP-10-8300）、Sephadex LH-20葡聚糖凝胶、C18-反相硅胶等提取分离手段,获得10个代谢物,包括2,4-二叔丁基苯酚（Y1）,3-（2-氨基乙基）吲哚（Y2）,多粘菌素B1（Y3）,多粘菌素E2（Y4）,N-乙酰-5-甲氧基色胺（Y5）,2,4-二羟基-5-甲基嘧啶（Y6）,谷胱甘肽（Y7）,甘露醇（Y8）,对羟基苯甲酸（Y9）,丝氨酸（Y10）。利用~1H NMR、13C NMR和高分辨率质谱对此10个化合物的结构进行了鉴定。3.用浊度法和盆栽剪叶法,针刺法对活性代谢物的活性进行检测,结果如下:（1）在200μg/m L的浓度下,多粘菌素B1和E2对Xoo和Xoc有明显的体外抑制作用,对Xoo的EC50值分别为0.19μg/m L和0.21μg/m L,对Xoc的EC50值分别为0.32μg/m L和0.41μg/m L,均优于中生霉素（分别为0.31μg/m L和0.73μg/m L）和叶枯唑（分别为77.48μg/m L和85.30μg/m L）。多粘菌素B1和E2在体内对水稻白叶枯病（BLB）和水稻细菌性条斑病（BLS）具有良好的保护和治疗作用。多粘菌素B1对BLB的保护和治疗活性分别为45.8%和35.8%,多粘菌素E2的保护和治疗活性分别为41.2%和37.0%,均优于中生霉素（分别为34.8%和29.8%）和叶枯唑（分别为38.0%和33.5%）。同时,多粘菌素B1对BLS的保护和治疗活性分别为44.8%和39.8%,多粘菌素E2的保护和治疗活性分别为42.9%和39.9%,也优于中生霉素（分别为39.7%和32.0%）和叶枯唑（分别为41.5%和34.3%）。（2）在200μg/m L的浓度下,2,4-二叔丁基苯酚、N-乙酰-5-甲氧基色胺、对羟基苯甲酸对Xoo和Xoc也有良好的抗菌活性。体外实验发现,2,4-二叔丁基苯酚、N-乙酰-5-甲氧基色胺、对羟基苯甲酸对对Xoo的EC50值分别为49.45μg/m L、64.22μg/m L和16.32μg/m L,对Xoc的EC50值分别为34.33μg/m L、71.17μg/m L和15.58μg/m L。比中生霉素（分别为0.42和0.82μg/m L）差,但是优于叶枯唑（分别为85.64和92.49μg/m L）相比。体内实验发现,2,4-二叔丁基苯酚（分别为35.9%和35.4%）、N-乙酰基-5-甲氧基色胺（分别为42.9%和36.7%）和对羟基苯甲酸（分别为40.6%和36.8%）对BLB具有良好的保护和治疗活性,其效果优于中生霉素（分别为38.4%和34.4%）。4.基于多粘菌素B1对BLB良好的保护活性。取用200μg/m L的多粘菌素B1保护后接种Xoo的水稻叶片,并酶解用LC-MS/MS进行分析。使用基因本体论（GO）注释（http://www.geneontology.org/）和京都基因和基因组百科全书（KEGG）注释（http://www.genome.jp/Pathway）分析差异表达蛋白（DEPs）。然后,使用Uniprot软件（http://www.uniprot.org/）搜索数据库。结果显示,共有12条途径被富集,包括苯丙烷生物合成途径、MAPK信号通路、脂肪酸降解、色氨酸代谢、赖氨酸降解等。其中16种DEPs在苯丙烷生物合成途径中富集,包括反式肉桂酸-4-单加氧酶（CYP73A）、β-葡萄糖苷酶（GLU）、肉桂酸脱氢酶（CAD）和过氧化物酶（POD）。有9种上调蛋白（A0A0N7KI36、A0A0P0XR31、Q5JMS4、Q94DM2、A2YPX2、Q6ZCC2、Q6K4J4、Q7XSU7和Q7XSU8）和2种下调蛋白（A0A0P0V2C2、Q9AS12）参与POD的调节。同时,CAD（Q8H859、Q6ERW9和Q6ERW7）和GLU（Q60DX8）蛋白表达上调,而CYP73A（A2Y375）表达下调。众所周知,POD和CAD能够调节木质素的形成,木质素可以提供结构支持,通过物理屏障防止病原体入侵,并在植物中充当防御成分。CAD和POD的上调可以提高植物对入侵病原体的抗性,降低感染发生率。结果表明,多粘菌素B1可通过上调水稻CAD和POD来增强水稻对Xoo病菌的抗性。用平行反应监测（PRM）以确认16个DEPs与苯丙烷生物合成途径的潜在关系。16个DEPs的表达水平与蛋白质组学分析结果一致。三种POD蛋白显著上调,包括Q94DM2、Q6ZCC2和Q7XSU7。值得注意的是,与Xoo组（PB/CK）相比,Xoo用PB1处理后Q7XSU7的表达水平增加了17.64倍。同时,Q94DM2和Q6ZCC2蛋白的PB/CK比值分别为9.89和8.34。与对照组相比,CAD组的Q8H859和Q6ERW9表达水平上调2.34倍和2.19倍。在苯丙烷生物合成途径的DEPs中,A0P0V2C2、Q9AS12和A2Y375被下调。PRM结果表明,多粘菌素B1可显著影响POD的表达水平,进而调节苯丙烷生物合成途径,这与DEPs分析一致。