据相关文献报道,目前肝癌已位居我国癌病发病率第四位及死亡率第二位,使我国广大人民的健康遭受严重威胁。而在世界水平上肝癌发病率在常见恶性肿瘤中占第六位。虽然在全球范围内乙肝患者受到越来越多的重视,但是由于经济条件和区域的不同,肝癌的早期诊断仍不尽完善。尤其是经济落后的农村及偏远山区的患者直到出现临床症状才开始就诊,此时癌症大多已发展到中晚期。而当今对于中晚期肝癌的治疗,一直以来都是我们面临的难题。尽管有多种治疗方法可供选择,但是均难以实现患者的长期生存。每一种新药的问世,都会引起医学界的巨大反响,随之而来的也有许多问题需要我们去面对。最为关键的就是几乎每一种化疗药物的长期应用都会产生耐药。安罗替尼作为我国研发的新型小分子酪氨酸酶激酶抑制剂能有效抑制VEGFR、PDGFR、FGFR、c-Kit等激酶,具有抗肿瘤血管生成和抑制肿瘤生长的作用。其进行的临床试验包括非小细胞癌、软组织肉瘤、胃癌、结直肠癌、甲状腺髓样癌、分化型甲状腺癌以及食管鳞癌等。关于安罗替尼对肝细胞癌的报道目前少见,尤其是关于安罗替尼耐药性方面的研究几乎没有。本课题拟研究安罗替尼在肝癌中耐药的可能机制,为以后的临床和实验提供理论依据。本课题从以下三个部分进行研究:第一部分通过大剂量冲击联合持续低剂量安罗替尼浓度递增的方法培养肝癌耐药株,结合CCK8实验来确定成功培养出耐药株。第二部分我们通过Transwell和划痕愈合实验来比较耐药肝癌细胞株与正常肝癌细胞株的迁移和侵袭能力的变化。第三部分我们通过基因芯片来探索安罗替尼在肝癌中耐药的相关机制。第一部分 对安罗替尼耐药的肝癌细胞株的建立目的建立对安罗替尼耐药的肝癌细胞株。方法1.通过大剂量冲击联合低剂量诱导的方法培养出对安罗替尼耐药的肝癌细胞株。2.用CCK8的方法来检测安罗替尼对肝癌细胞的半数抑制率及验证成功培养出耐药的肝癌细胞株。结果正常肝癌细胞半数抑制率为2.99umol/L,培养成功的耐药癌株半数抑制率为27.85umol/L。对安罗替尼耐药的肝癌细胞株培养成功。第二部分 耐药肝癌细胞株细胞表型的变化目的通过体外实验研究对安罗替尼耐药的肝癌细胞株的细胞表型的变化方法1.利用Transwell法检测对安罗替尼耐药的肝癌细胞株的迁移和侵袭能力的变化。2.利用细胞划痕愈合实验检测肝癌耐药细胞株迁移能力的变化。结果对安罗替尼耐药的肝癌细胞株侵袭和迁移能力较正常肝癌细胞株增强。(P<0.5)。第三部分 肝癌细胞株耐药机制的相关研究目的研究耐药肝癌细胞株与正常肝癌细胞株之间差异表达的基因,从而推断出可能存在关键RNA及信号通路,为进一步的临床实验提供理论基础。方法1.运用基因芯片检测耐药肝癌细胞株与正常肝癌细胞株的基因表达差异。2.用qRT-PCR对部分芯片测出的基因差异进行验证。结果1.耐药肝癌细胞株与正常肝癌细胞株基因表达差异较大(P<0.5),我们通过缩减范围筛选出差异最大的10个基因进行分析。与耐药和肿瘤生长有关的有4个分别为 BIRC2、BIRC7、ABCC2、MAPK8。其中 BIRC2、ABCC2、MAPK8表达量下降(P<0.5),BIRC7的表达量增多(P<0.5)。2.qRT-PCR检测出的结果与基因芯片测出的结果一致。全文结论1.对安罗替尼耐药的肝癌细胞株培养成功。2.对安罗替尼耐药后,肝癌细胞株在体外实验中侵袭和迁移能力变强。3.通过基因芯片测序结果我们发现,BIRC7可能参与了肝癌细胞株对安罗替尼耐药的过程。