背景:根据世界癌症统计的结果,食管癌是最常见的恶性肿瘤之一。根据报道,食管癌发病率位列全部恶性肿瘤中第8位,死亡率位列第6位。从发病率男女比例来看,男性明显高于女性。在中国平均每年约有25万新增的食管癌患者,数量占全球食管癌新增患者数的一半以上。不同于西方国家,食管鳞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)仍是我国乃至东亚最普遍的食管癌类型。食管鳞癌、食管腺癌两者的病理学类型与好发部位不同,其发生的危险因素、生物学行为、好发部位、治疗敏感性等方面均有不同。因此,目前针对食管鳞癌的相关研究正在如火如荼的开展,有望能够发现亚洲食管鳞癌发生发展以及生物学行为独特的分子生物学机制。食管鳞癌不仅具有高发病率,其还具有高侵袭性以及预后差等特点,在肿瘤进展的方式中,食管鳞癌早期发生转移是导致预后不佳的主要原因之一。而淋巴结转移是食管鳞癌的主要转移方式,其与食管鳞癌的分期、预后情况明显相关。近年来有文献报道,随着全基因组测序技术的快速发展,学者们发现编码蛋白质的编码序列所占比例很少,全人类基因组中参与进行编码蛋白质组的部分只有不到1-2%。很长一段时间,因为非编码RNA并不直接参与编码蛋白组,其功能一度被忽略。从发现有非编码RNA参与P53通路,并同时参与生物学调节过程开始,越来越多的学者研究并关注非编码RNA,尤其是针对非编码RNA在肿瘤的发生、发展过程中作用的研究逐渐增多。长链非编码RNA(lncRNA)是RNA分子的一个特殊类型,lncRNA是指RNA分子的转录本长度超过200核苷酸,lncRNA一般不直接参与编码蛋白,或者只是参与编码短多肽。相比于与研究比较深入的与蛋白编码相关的RNA,lncRNA的研究才初步兴起,针对lncRNA的基因表达以及其在肿瘤发生发展中作用的研究将不断深入。有理由相信,lncRNA可能是继编码RNA后的又一个明星分子。在食管癌研究领域,根据文献报道,亦有部分关于lncRNA参与肿瘤的发生发展的各个过程的研究,如有研究者鉴定出lncRNA通过调控下游靶基因的甲基化水平从而调节食管癌生物学过程。有研究者推测lncRNA可作为食管癌早期筛选及诊断的潜在生物标志物。有研究者证明高表达的lncRNA与肿瘤细胞增殖、侵袭、粘附相关。有研究者发现高表达的食管鳞癌相关lncRNA能够促进食管癌细胞的侵袭转移并诱导肿瘤细胞出现耐药性。这些研究结果显示,在食管癌发生、发展过程中,部分lncRNA的表达水平发生了特征性的改变,这些lncRNA通过调控某些重要信号转导通路,调节下游靶基因的表达,从而影响食管癌的发生、发展。利用高通量测序技术进行癌症发病机制研究是目前食管癌研究领域的热点。在我们的前期工作中,完成了对食管鳞癌组织及其对应癌旁正常组织的高通量转录组学测序,并对基因的表达水平进行了筛选比较,发现食管鳞癌样本中lncRNA的表达水平发生了显著的变化,这说明lncRNA的差异性表达在食管癌发生、发展中可能扮演着重要的角色。因此我们拟利用分子生物学及细胞生物学实验,通过在体外培养食管鳞癌细胞系,建立食管鳞癌动物模型,结合收集到的食管鳞癌患者手术病理样本,以期筛选出有意义的差异性表达的lncRNA,探讨其在食管鳞癌增殖侵袭生物过程中的功能,并研究其与食管癌预后的关系,以期从另一个方面了解该差异性表达lncRNA的作用。我们拟通过本研究,进一步揭示食管鳞癌的发展机制,有望为食管癌的诊断、治疗和预后判断提供有效且特异的生物标志物,为其临床诊疗提供新的方向。方法:本研究采用42对ESCC和匹配的来自ESCC病例的相邻非肿瘤组织样本,非肿瘤组织样本取自相应患者自体癌旁正常组织。所有患者均在作者所在医院进行了组织病理学和临床诊断和外科治疗。所有患者均接受胸腔镜联合腹腔镜微创食管癌切除术,以及胃代食管左颈吻合术,淋巴结清扫范围为二野(胸野、腹野)或三野(颈野、胸野、腹野)淋巴结清扫。患者术前均未接受过局部或系统抗肿瘤治疗。从病历中收集临床信息。我们通过门诊、电话随访确定存活数据。我们应用总RNA提取试剂TRIzol reagent提取标本(食管鳞癌组织与癌旁正常组织)中的总RNA。RNA的质量检测内容包括纯度、浓度与完整性。使用二代测序平台Hiseq-2500完成高通量测序。通过建立cDNA文库并进行生物信息学分析,从而筛选出差异性表达的lncRNA。使用qRT-PCR法对全部样本的差异性表达lncRNA的表达水平进行验证。并使用核质分离实验检测差异性表达lncRNA的细胞定位。选择小干扰RNA(siRNAs)和一种无明确靶点的阴性对照(NC)转染ESCC细胞系。观察转染后的细胞系的增殖情况。使用Transwell方法对转染后细胞系的迁移和侵袭能力进行检测。将带有NC或siRNA的转染细胞皮下注射到裸鼠体内,在6周观察期结束时,处死小鼠,取出肿瘤组织并称重。将差异性lncRNA与预后相关指标进行联合分析。收集患者的临床病理资料。探讨差异性表达的lncRNA在不同临床病理情况下的表达情况。我们通过使用Kaplan-Meier生存分析,研究差异性表达lncRNA以及各临床病理特征与生存率的关系,并绘制生存曲线,采用Log-rank法进行检验。我们进一步进行单因素与多因素分析,分析并找出可能影响术后生存率的独立危险因素。使用Ber-Ep4,CD44v6单克隆抗体联合检测食管鳞癌区域淋巴结微转移情况。针对差异性表达的lncRNA以及各个患者的局部淋巴结微转移情况,采用Sperman相关性分析,探讨差异性表达的lncRNA与淋巴结微转移阳性情况之间的相关性。结果:RNA质量检测结果显示各个样本纯度及浓度符合实验要求。琼脂糖凝胶电泳方法检测结果显示各个样本RNA的完整性良好。所有样本通过RNA质量控制。使用高通量测序技术,对2对食管鳞癌组织及其对应癌旁正常组织,进行测序。分析食管鳞癌中差异性表达的lncRNA倍数变化,设定变化倍数在1.5倍以上的为有意义改变。测序分析结果显示筛选出一组差异性表达lncRNA,变化倍数(包括高表达与低表达)在1.5倍以上的lncRNA共181个,其中86个lncRNA在ESCC组织中相对高表达,95个lncRNA在ESCC组织中相对低表达。采用生物学信息分析的方法,发现LINC00680是在ESCC组织中表达上调最多的lncRNA之一,在本研究中,我们选择LINC00680作为研究的目标lncRNA。使用GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)与CCLE(Cancer Cell Line Encyclopedia)数据库检索,结果显示在包括食管癌在内的多种癌细胞中,LINC00680亦呈高表达情况。我们利用UCSC Genome Browser完成对目标lncRNA的基因注释。我们使用qRT-PCR方法检测42例配对样本中LINC00680的表达水平。结果表明,LINC00680在90.5%(38/42)的癌组织中有明显的高表达,肿瘤组织的LINC00680表达情况与癌旁正常组织的表达情况存在显著性差异,上调倍数中位数为2.09(P<0.001)。我们进行了qRT-PCR分析,以评估LINC00680在ESCC细胞系中的表达。结果显示,与人正常食管上皮细胞系(HEEC)相比,两个细胞系(KYSE140和KYSE510)中的LINC0680表达水平相对较高。核质分离试验结果显示,大部分LINC00680表达主要集中在细胞核中而不是细胞质中。设计合成了两种siRNA(siRNA-1和siRNA-2),转染后的细胞系中,LINC00680的表达被有效抑制。细胞增殖实验结果显示,在KYSE140、KYSE510细胞系中,使用siRNA敲低LINC00680可显著抑制ESCC细胞增殖。其中siRNA-1抑制LINC00680细胞增殖的效能更加显著。迁移与侵袭实验结果显示,siRNA转染的ESCC的迁移率以及侵袭能力显著降低。裸鼠异种移植实验结果显示抑制LINC00680基因表达后,ESCC异种移植物的体内生长能力也受到抑制。通过LINC00680与食管鳞癌临床病理因素之间的关系分析,结果显示,LINC00680的表达水平与年龄、吸烟情况、肿瘤长度、淋巴结转移和TNM分期显著相关(P<0.05)。而LINC00680的表达与性别、家族史、肿瘤位置、分化或T期无关。LINC0680高表达的患者生存率明显低于LINC00680低表达的患者。单因素分析结果显示,除了LINC00680的表达情况外,N分期、TNM分期也是ESCC患者总生存率的重要的预后因素。而性别、年龄、吸烟状态、家族史、肿瘤位置、肿瘤大小、分化程度与T分期与生存率无明显相关。多因素分析结果表明,LINC00680的表达是导致总生存率下降的唯一独立因素(HR:3.192,95%CI:1.197-8.510,P=0.020)。食管癌区域淋巴结微转移检测方面,Ber-Ep4与CD44v6同时阳性表达率为26.2%(11/42)。根据qRT-PCR检测到的LINC00680的表达水平。采用Spearman相关性分析两者的关系,结果显示二者表达呈正相关(r=0.487,P=0.001),提示LINC00680的表达情况与淋巴结微转移检测结果存在显著的相关性。结论:综上所述,我们的研究结果显示LINC00680为一种新的ESCC潜在癌基因,它在细胞增殖、迁移和侵袭中起到重要作用。而LINC00680可能是ESCC潜在的重要预后因子。然而,在ESCC中,LINC00680相关细胞迁移和侵袭的潜在机制仍不清楚。进一步的研究有助于更深入了解ESCC中LINC00680的作用机理。