蒙古羊是我国数量较多、分布最广、抗逆性和适应性很强的绵羊品种,是对其他地方品种绵羊进行选育和改良的宝贵遗传素材。采用人工授精技术对绵羊进行改良,是促进现代绵羊养殖产业快速发展的重要手段。冷冻精液可以最大程度发挥优秀蒙古羊种羊的优势,但目前蒙古羊精液的体外冷冻保存依然存在精子质量减弱、受胎率偏低的技术瓶颈,限制了其在绵羊改良及繁育中的推广。国内相关研究多集中在探究冻存导致的精子形态学变化及通过添加冷冻保护剂优化冷冻程序等方面,对冻存造成精子质量偏低的损伤机制研究不够深入。鉴于此,我们首次对蒙古羊冻存前后的精子进行蛋白质组测序,经生物信息学分析挖掘冻存影响精子质量的关键蛋白,采用免疫共沉淀技术确定与关键蛋白互作的蛋白,构建蛋白质间的互作网络,揭示冻存造成精子损伤的机制。在此基础上尝试在冷冻液中添加抗氧化物质——白藜芦醇（Res）,检测其对冻精质量及筛选到的关键蛋白是否起到保护作用。主要研究结果如下:1.冻存造成蒙古羊精子活力下降及质膜结构损伤。冻存前蒙古羊精子平均活力为78.7%,冻存后平均活力下降到40.33%,可见冻存导致精子活力显著下降（P＜0.01）;冻存前精子质膜完整性为83.87%、畸形率仅为7.83%,冻存后精子质膜完整性降到51.27%、畸形率上升到20.85%,表明冻存导致精子结构发生显著损伤（P＜0.01）。2.冻存导致蒙古羊精子蛋白质组发生了明显变化。鲜精组与冻精组比较共鉴定到89种差异蛋白质,其中上调41种、下调48种（P＜0.05）。差异蛋白质GO富集的细胞组分主要涉及线粒体基质、超氧化物歧化酶活性、氧化磷酸化;KEGG富集大多集中于乙醛酸和二羧酸代谢、丙酸代谢、柠檬酸循环等能量代谢通路。经生物信息学分析发现,2-氢硫辛酰胺脱氢酶（DLD）与活性氧（ROS）相关蛋白烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶1β亚复合物亚单位9（NDUFB9）两个蛋白位于精子能量代谢调控通路的关键节点,直接影响精子细胞ATP的合成,是导致精子活力下降的关键蛋白。3.明确了与DLD互作的蛋白主要为丙酮酸脱氢酶E1β亚单位（PDHB）和异柠檬酸脱氢酶γ亚基（IDH3G）。通过免疫共沉淀显示PDHB和IDH3G分别与DLD相结合,其中DLD与PDHB互作共同调控丙酮酸脱氢酶复合物（PDC）的活性,从而对TCA循环进行调节;DLD与IDH3G互作共同维持TCA循环ATP的产生,进而调控精子的能量代谢。4.添加Res能够明显改善冻存后精子质量,并能稳定DLD和NDUFB9蛋白的功能。冻存前在精子冷冻液中添加15μmol/L的Res（FF-Res组）,冻存后精子活力可达65.85%,相较于未添加Res冻存组（FT组）的57.95%,精子活力显著提升（P＜0.01）。蛋白免疫印迹分析显示,FF-Res组DLD、NDUFB9的蛋白量显著高于FT组（P＜0.01）。综上,本研究表明冷冻保存造成精子能量代谢关键蛋白DLD和NDUFB9的显著下调,导致PDC活性降低、TCA循环ATP合成减少、能量供应不足等一系列反应,最终引起精子质量明显下降。研究结果为全面揭示冻存造成蒙古羊精子质量损伤的分子机制奠定了重要的基础,也为后续利用DLD进一步优化冷冻程序,提高精子质量提供了科学依据。