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目的:组织残留是暴力犯罪现场极具代表性的一种生物检材,涉及组织碎片、刀枪擦拭物或衣物上残留的组织斑迹等。分析与犯罪有关的生物检材的存在和组织溯源是揭示犯罪本质的关键,尤其在涉及尸体肢解等的暴力犯罪现场重建过程中,组织溯源可以为DNA的组织来源提供重要的信息。近年来,非编码环状RNA（circular RNAs,circRNAs）正逐渐进入人们的视野,成为RNA领域的一个研究热点。circRNAs的表达水平具有组织特异性,并且circRNAs分子呈闭合环状结构,不易被核酸外切酶降解,较线性RNA更加稳定,对于法医陈旧降解检材的分析更具优势。本研究拟从TSCD（Tissue-Specific Circ RNA Database,TSCD）（http://gb.whu.edu.cn/TSCD/）数据库及文献数据中,筛选出人类组织特异性的circRNAs标记;收集人体组织样本,采用q RT-PCR方法对候选circRNAs进行组织表达特异性分析,以期找到各组织特异性circRNAs分子标记物,应用于法医人体器官组织溯源。方法:1. 样本采集及保存:（1）法医尸检过程中提取5名个体组织样本,用于circRNAs组织特异性验证,组织来源个体编号为1-5号。其中包括心脏5例,大脑5例,肝脏5例,皮肤4例,骨骼肌5例,肺脏、肾脏、脾脏、胰腺、甲状腺、小脑、胃各1例。每例样本约300mg,2cm3,排除明显腐败或病理改变的器官。提取样本后,立即浸泡于20倍组织块体积的RNA保护液中,4℃过夜后-80℃保存待检。（2）提取1名尸检个体组织样本（包括心脏、大脑、肝脏、皮肤和骨骼肌组织）,用于circRNAs稳定性研究,组织来源个体编号为6号,每例样本约5cm3。提取组织后,将各组织直接分成0.8cm3左右大小,放置于培养皿中,并置于温度15℃、相对湿度45%的恒温恒湿箱中,分别于0天、7天、14天、21天、28天、56天提取RNA进行分析。（3）从Ta Ka Ra公司购买人体心脏、大脑皮层、肝脏、骨骼肌组织总RNA样本各1例。2. circRNAs分子标记筛选:从TSCD数据库中,筛选出5种成人组织（心脏、肝脏、皮肤、骨骼肌、肺脏）中表达丰度较高的22种组织特异性circRNAs,从文献中筛选出3个大脑组织特异性的circRNAs,作为候选分子标记,进行组织特异性验证。3. RNA提取及定量:采用TRIzol法提取上述人体组织样本总RNA,采用Nano Q微型分光光度计评估RNA质量和纯度。Labchip GX Touch RNA测量RNA质量分数RQS（RNA Quality Score）值,评估RNA的完整性。4. q RT-PCR验证候选circRNAs:（1）选取18S rRNA、β-actin、GAPDH、U6作为候选内参基因,评估四种内参基因在不同组织中的表达情况,选取在不同组织间表达稳定的标记作为q RT-PCR的内参基因。（2）设计位于circRNA环化位点两侧的反向（divergent）引物,通过SYBR Green q RT-PCR技术,检测组织特异性候选circRNAs在不同人体器官组织中的表达水平。记录CT值（CT值是指在指数增长阶段荧光报告基团的荧光信号达到阈值时所经历的PCR循环次数）,以ΔCT（候选circRNA）=CT（候选circRNA）-CT（内参基因）代表某circRNAs在某组织中的表达水平;对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,观察其扩增产物情况;采用Sanger法测序验证circRNAs的引物特异性及产物序列特征。5. 潜交叉组织试验:提取人体肺脏、肾脏、脾脏、胰腺、甲状腺、小脑、消化道RNA样本,进行q RT-PCR检验,并结合CT值和琼脂糖凝胶的结果,判断各circRNAs的特异性。6. 灵敏度检验:对购买的人体器官组织RNA（心脏、大脑皮层、肝脏、骨骼肌）和提取的3号个体皮肤组织RNA进行10倍系列梯度稀释,初始模板量分别加入100 ng、10 ng、1 ng、0.1 ng和0.01 ng,分析检测方法的灵敏度。7. circRNAs稳定性评估:对于在恒温恒湿箱中制备的人体器官组织腐败样本,分别于0天、7天、14天、21天、28天、56天,采用q RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳方法,分析样本中circRNAs的表达水平,初步评估circRNAs的稳定性。8. 统计学分析:应用Excel及SPSS v21.0软件对上述实验结果进行单因素方差分析等统计学分析。结果:1.候选内参基因评估:在4个候选内参基因18S、β-actin、GAPDH、U6中,U6在不同组织中的表达更为稳定。2.本实验从数据库和文献中共筛选出25个circRNAs,其中12个circRNAs能够设计出较理想的反向引物。经q RT-PCR方法验证,最终确定8个circRNAs具有明显的组织特异性（P<0.01）。分别为chr4:95529209|95561601+（心脏特异性）,hsa＿circ＿0000296、hsa＿circ＿0000417（大脑特异性）,chr19:10183599|10184111+（肝脏特异性）,chr1:152324865|152325090-（皮肤特异性）,chr2:152544139|152550950-、chr2:152544805|152551143-、chr2:152496868|152499867-（骨骼肌特异性）。琼脂糖凝胶电泳结果显示,心脏特异性circRNA chr4:95529209∣9556160+在心肌组织中的扩增产物条带清晰,在肝脏组织中条带亮度低,在其余脑、皮肤和骨骼肌组织中无明显产物条带,提示在这三种组织中不表达,该circRNA能以“全或无”的方式区分心脏、肝脏与脑、皮肤、骨骼肌组织;肝脏特异性circRNA chr19:10183599∣10184111+在肝脏组织中扩增产物条带清晰,在骨骼肌组织中条带亮度低,在其余心脏、脑、皮肤组织中无明显产物条带,提示在这三种组织中不表达,该circRNA同样能以“全或无”的方式区分肝脏、骨骼肌与心脏、脑、皮肤组织。3.Sanger测序:8个circRNAs均测序成功,拼接位点位置均为预测的节点,且序列与数据库及文献报道结果一致。4.潜交叉组织验证:8个circRNAs在潜交叉组织中的表达水平均低于其特异性表达组织,且某些circRNAs在某些潜交叉组织中不表达（CT>35）或表达量很低,显示出相对较好的组织特异性。5.灵敏度检验:采用q RT-PCR方法,在8个circRNAs中,chr4:95529209|95561601+,chr19:10183599|10184111+的最低可检测RNA加入量为0.1ng,其余circRNAs的最低模板量为0.01 ng。6.circRNAs稳定性检验:心脏特异性circRNA chr4:95529209|95561601+最长于21天可在心脏组织中检出（CT<35）,其余7种circRNAs至56天在相应的目标组织中仍可检出,且琼脂糖凝胶电泳可观察到明显的条带。结论:circRNAs有望成为又一重要的组织器官识别分子标记物。本研究利用TSCD数据库和文献中筛选出25个人体组织特异性circRNAs,并成功验证出8种circRNAs分子分别具有心脏（1）,大脑（2）,肝脏（1）,皮肤（1）,骨骼肌（3）组织特异性;评估了circRNAs在放置至56天之久的人体组织样本中的稳定性;研究构建的用于circRNAs定量的q RT-PCR方法检测灵敏度较高。实验结果表明,circRNAs具有较理想的稳定性和人体器官组织表达水平差异性,可以作为法医组织鉴别的新的遗传标记,继续深入研究。