论文部分内容阅读
转基因动物制备过程中,外源基因的表达水平受到很多因素的影响,其中表观遗传修饰是影响外源基因表达效率的一个重要因素。表观遗传修饰中,由花斑抑制因子同源物(suppressor of variegation3-9homolog1SUV39H1)基因所催化的组蛋白H3第9位赖氨酸残基位点的二甲基化和三甲基化(H3K9me2/3)作用尤为突出。本研究对抑制水牛SUV39H1基因表达的shRNA干扰序列进行了筛选,通过抑制稳定表达干扰素a-2b(interferon a-2b IFNa-2b)的Bcap-37细胞系中内源SUV39H1基因的表达,探讨其对外源转IFNa-2b基因表达效率的影响及其作用机理,为寻找提高转基因动物中外源基因的表达效率提供新的思路和方法。一、SUV39H1表达载体构建及其shRNA片段的筛选1.克隆水牛SUV39H1基因3’UTR和ORF全长序列,预测水牛SUV39H1基因的miRNA序列,构建表达水牛SUV39H1基因的融合表达载体,并在细胞水平上进行检测。结果发现,与黄牛相比,水牛SUV39H1基因的ORF和3’UTR序列与其同源性分别为99%和95%；ORF序列比3’UTR序列在不同物种间表现出更强的保守性；SUV39H1基因融合表达重组质粒可以在293T细胞中表达。2.利用组织切片和免疫组化技术,检测了不同发育阶段水牛卵泡SUV39H1基因的表达规律。结果发现,SUV39H1基因在各级卵泡卵母细胞的表达趋势是随着卵泡的发育成熟而逐渐降低。水牛各发育阶段卵泡的颗粒细胞中,SUV39H1基因表达水平较高,随着卵泡的发育成熟,SUV39H1基因在颗粒细胞中的表达呈逐渐增强趋势；在卵母细胞中,只有原始卵泡中的卵母细胞细胞质和细胞核SUV39H1基因表达呈较强阳性,在初级和次级卵母细胞的细胞质和细胞核中,SUV39H1呈较弱阳性表达,在卵丘-卵母细胞复合体细胞质中呈弱阳性表达,细胞核中呈阴性表达。各级卵泡的卵泡膜中,均未发现SUV39H1基因的表达。3.针对水牛SUV39H1基因CDS序列,设计了2条shRNA片段,并构建了其慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shSUV39H1/2和阴性对照质粒pSicoR-GFP-1864。酶切和测序鉴定正确后,将shRNA表达载体质粒和水牛SUV39H1表达载体质粒按照质量比3：1的比例进行293T细胞共转染,通过qRT-PCR和Western-blot方法检测shRNAs的抑制效率。qRT-PCR结果表明,SUV39H1基因表达在阴性对照组和空白组中的表达差异不显著(P>0.05)；相对于阴性对照组,实验组中的shRNA1和shRNA2片段对SUV39H1基因的干扰效果差异显著(P<0.05),干扰效率分别达到33.85%和78.75%。Western-blot分析发现,SUV39H1蛋白在阴性对照组和空白组中条带清晰明显,两个干扰实验组中SUV39H1蛋白表达量均降低,与qRT-PCR结果相符合。二、SUV39H1基因shRNAs对转IFNa-2b基因细胞相关基因表达的影响。采用磷酸钙转染方法包装SUV39H1基因shRNA1和shRNA2高滴度慢病毒。利用病毒感染稳定表达IFNa-2b基因的Bcap-37细胞系,72h后收集细胞样品,采用qRT-PCR和或Western-blot方法检测SUV39H1、IFNa-2b、 DNMT1、HDAC1、HAT1和G9a基因表达。结果显示,在相同MOI病毒感染条件下,SUV39H1基因shRNA1和shRNA2片段对SUV39H1基因表达均具有显著的抑制效果,干扰效率分别为53.07%和31.28%。与阴性对照组相比,shRNAs病毒感染细胞中IFNa-2b基因的表达量差异显著(P<0.05),分别提高96.25%和121.08%。此外,与SUV39H1基因功能相关的几个基因中,与对照组相比,DNMT1, HDAC1和G9a基因的表达显著降低(P<0.05),HAT1基因的表达量显著提高(P<0.05)。以上结果为利用SUV39H1基因的表达调控提高转基因动物中外源基因的表达效率奠定了基础。以上结果表明,筛选得到的2条shRNAs能够有效抑制水牛SUV39H1基因的表达；在稳定表达IFNa-2b基因的Bcap-37转基因细胞系中,SUV39H1基因的表达抑制可以有效提高IFNa-2b基因的表达。