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内毒素血症是由于血液中细菌或病灶内细菌释放出大量的细菌内毒素至血液或输入大量的内毒素污染的液体而引起的一种病症。内毒素血症可以引起机体一系列的病理生理改变,如生物体的发热反应,促进血管活性物质释放而导致微循环障碍。内毒素致病机理复杂,可以通过激活多种细胞,产生大量细胞因子及炎症介质,引发全身炎性反应综合症(SIRS)、脓毒症,进而发展为脓毒症休克、多器官功能障碍综合征(MODS),最终导致死亡。肝脏是人体重要的代谢器官,它既是内毒素清除的场所又是内毒素血症最易损伤的器官之一。内毒素血症时大量细胞因子和炎症介质激活导致肝脏损伤,肝脏不能有效的清除血液中的有毒物质,大量有毒物质在体内蓄积,体内多种代谢途径失调,从而诱发加重一个或多个器官功能障碍。研究表明,在许多器官中都存在局部肾素-血管紧张素(RAS),并且局部RAS与脓毒症时各个组织器官缺血、缺氧及缺血-再灌注损伤有着密切的关系。目前关于内毒素血症时肝脏损伤的机制还不是十分清楚,故探讨大鼠内毒素血症时机体肝脏局部RAS的动态变化,对研究内毒素血症肝脏损伤的病理机制有重要的意义。本实验通过研究大鼠内毒素血症时肝脏RAS的动态改变,为进一步认识内毒素血症、脓毒症及MODS时脏器损伤的发生机制及治疗提供新的途径,有利于提高脓毒症及MODS的抢救成功率,降低其病死率。
材料和方法Wistar大鼠90只,随机分为模型组(腹腔注射LPS后2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时、7天组),每组10只,分别于腹腔注射LPS(10mg/kg)后不同时间点处死动物,严格按照无菌操作规程心脏取血,测定血清(浆)内毒素、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-10(IL-10)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、肾素(RENIN)、血管紧张素转换酶(ACE)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及肝功能。取肝组织,用10%甲醛液固定,石蜡包埋,常规病理切片,常规HE染色,光镜观察。对血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)进行免疫组织化学染色和RT-PCR。
统计学方法采用SPSS11.5通用统计学软件处理数据,实验数据均以均数±标准差(X±SD)表示。先进行数据的正态性检验、方差齐性检验,符合上述条件者行单因素方差分析,不符合上述条件者行秩和检验。P<0.05为差异显著性,P<0.01为差异非常显著。
结果1.模型组大鼠腹腔注射LPS2小时血浆内毒素水平显著升高并达到高峰,与正常对照组比较,差异非常显著(P<0.01),随着时间的推移血浆内毒素水平逐渐下降,4小时、8小时、12小时、24小时、48小时、72小时血浆内毒素水平与正常对照组比较仍有显著性差异(P<0.01),直到注射LPS7天,血浆内毒素水平与正常对照组比较无显著性差异(P>0.05)。
2.模型组注射LPS2小时血清TNF-α升高达高峰,随后开始下降,2小时、4小时与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01),到8小时血清TNF-α下降至正常水平(P>0.05)。血清IL-10的变化趋势与血清TNF-α变化趋势一致,即在注射LPS2小时达高峰,而后开始下降,2小时、4小时、8小时与正常对照组比较有显著性差异(P<0.05),12小时降至正常水平(P>0.05)。
3.模型组NOS在注射LPS后开始升高,12小时达高峰,与正常对照组比较有非常显著性差异(P<0.01),此后开始下降,2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时与正常对照组比较有显著性差异,72小时降至正常水平(P>0.05)。血清NO的变化趋势与血清NOS变化趋势基本一致,即在注射LPS12小时达高峰,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01),而后开始下降,72小时降至正常水平(P>0.05)。
4.模型组在注射LPS后2小时血清ALT开始升高,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01),8小时达高峰,随后开始回落,72小时降至正常水平(P>0.05)。在注射LPS后2小时血清AST、LDH开始升高,8小时达高峰,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01),随后开始回落,血清AST于72小时降至正常水平(P>0.05),血清LDH于24小时降至正常水平(P>0.05)。
5.血浆PRA在注射LPS后开始增强,2小时达高峰,2小时、4小时、8小时、12小时、24小时与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01),之后开始逐渐下降,48小时下降至正常水平(P>0.05)。
注射LPS后血清ACE开始升高,8小时达高峰,2小时、4小时、8小时、12小时、24小时血清ACE与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01),之后开始下降,48小时下降至正常水平(P>0.05)。
血浆AngⅡ在注射LPS后开始升高,8小时血浆AngⅡ达高峰,2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时血浆AngⅡ与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01),之后开始下降,到72小时下降至正常水平(P>0.05)。6.肝组织PRA在注射LPS后开始增强,2小时达高峰,2小时、4小时、8小时、12小时、24小时与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01),之后开始逐渐下降,48小时下降至正常水平(P>0.05)。
注射LPS后肝组织ACE开始升高,8小时达高峰,2小时、4小时、8小时、12小时、24小时血清ACE与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01),之后开始下降,48小时下降至正常水平(P>0.05)。
肝组织AngⅡ在注射LPS后开始升高,8小时血浆AngⅡ达高峰,2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时血浆AngⅡ与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01),之后开始下降,到72小时下降至正常水平(P>0.05)。
7.肝脏病理变化肝脏病理结果显示大鼠腹腔注射LPS后,随着时间的推移,肝脏损伤逐渐加重,腹腔注射LPS后8小时和12小时后,肝脏损伤最严重。注射LPS后2小时,模型组肝细胞出现轻度肿胀,气球样变性,肝窦少量炎细胞浸润;注射LPS后4小时,肝细胞出现少量散在坏死,肝窦轻度扩张,炎性细胞浸润,汇管区也可见炎细胞浸润;注射LPS后8小时及12小时后,肝小叶内出现大量灶性坏死,中央静脉内皮下细胞坏死,肝窦轻度扩张,炎细胞浸润。
8.肝脏AT1R免疫组化结果免疫组化结果显示在正常对照组AT1R表达主要在血管内皮细胞,模型组AT1表达主要在肝窦、肝小叶周围、血管内皮细胞。其中模型组注射LPS8小时及12小时后,肝窦及肝小叶周围AT1R表达较正常对照组明显增多。
9.肝脏AT1RmRNART-PCR结果结果显示模型组肝脏AT1RmRNA在注射LPS后表达明显增多,注射LPS8小时后达高峰,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01),注射LPS4小时、12小时、24小时、48小时后肝脏AT1RmRNA表达与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01)。
结论1.大鼠腹腔注射LPS10mg/Kg成功制成大鼠内毒素血症模型。
2.大鼠内毒素血症时血清(浆)LPS、TNF-α、IL-10、NOS、NO增加,机体发生一系列炎症反应和抗炎反应,同时肝脏病理结果显示模型组肝脏细胞出现变性坏死,肝功能损伤。
3.循环及肝脏局部RAS激活,血浆(清)及肝脏局部肾素、ACE、AngⅡ明显增多,同时免疫组化和RT-PCR结果显示大鼠内毒素血症时肝脏AT1R及AT1RmRNA表达增多,提示肝脏局部RAS可能系内毒素血症肝损伤的机制之一。