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在合成生物学研究中,不同功能的基因线路和人工合成生态系统的设计及构建是近年来研究的热点,其在环境治理、人类健康和工业生产等方面具有重要应用价值。快速构建具有预期功能的线路或系统离不开特定工具和元件的开发。群体感应（quorum sensing,QS）是细菌根据细胞密度变化调节基因表达和协调群体行为的一种机制,也是合成生物学研究中常用的细胞间通讯工具。然而,QS系统间普遍存在的串扰现象限制了基于QS系统的复杂线路的构建。在关于LuxI/R型QS系统的正交性研究中,酰基高丝氨酸内酯（AHL）合成酶的表达对信号正交性的影响往往被忽略,这限制了对正交QS系统的进一步应用。不同功能基因线路的构建是合成生物学的主要研究方向之一,实现基因时序表达的级联线路具有重要的应用意义。此外,在人工合成系统的构建中,微生物群落的设计以及群落中生态关系的探索是合成生物学的新兴研究方向。自然界中存在较多难以控制和衡量的影响因素,而人工构建的合成生态系统具有高可控性和低复杂性的优势,对微生物群落的深入研究和应用具有重要意义。本论文以胞内表达AHL合成酶为前提,首先在大肠杆菌（Escherichia coli）中构建了同时满足启动子正交和信号正交的完全正交QS系统;随后,将完全正交的QS系统应用到人工基因线路的研究中,构建了自诱导级联线路;最后,完全正交的QS系统被应用到人工合成生态系统的设计中,构建了可调控种群数量比例的合成竞争和共生生态系统。1.完全正交QS系统的建立及其在人工基因线路构建中的应用本论文首先通过分析常用LuxI/R型QS系统间的正交和串扰关系,选择了根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）来源的Tra系统和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）来源的Las系统作为出发系统,进行完全正交QS系统的构建。Tra和Las系统之间启动子正交,但存在信号分子的串扰。为实现系统间信号正交,我们分析了两个系统对不同信号分子的敏感度,发现Las系统中的受体蛋白LasR对信号分子3OC6HSL的敏感度远低于3OC8HSL,而Tra系统中的受体蛋白TraR对3OC6HSL和3OC8HSL的敏感度相近。因此,为实现信号正交,我们利用Esa系统中的AHL合成酶EsaI合成3OC6HSL,作为Tra系统的信号分子。与Tra系统自身的信号分子3OC8HSL相比,3OC6HSL能在保证Tra系统激活表达的前提下,降低对Las系统的串扰激活。由于Tra系统在大肠杆菌中的表达水平较低,为提高其在大肠杆菌中的表达水平,该系统的Ptra启动子和TraR受体蛋白被分别替换为经过改造的Ptra*和TraR（W）,并被重新命名为Tra*系统。我们利用L-阿拉伯糖（Ara）诱导EsaI合成Tra*系统的信号分子3OC6HSL,以脱水四环素（aTc）诱导LasI合成Las系统的信号分子3OC12HSL,在E.coli TOP10中分别构建了 Tra*系统和Las系统的基础表达质粒。经过初始表征发现,两个系统均存在较严重的泄露表达。经过表征,确定了两个系统的泄露表达均是由信号分子的泄露产生造成。通过改造AHL合成酶的核糖体结合位点（RBS）以及启动子,成功地降低了两个系统的本底表达,获得了理想的改造系统和质粒。为了对两个系统进行全面的正交验证及串扰分析,本论文在两个基础表达质粒的基础上,通过删除受体蛋白或（和）群体感应启动子,构建了一系列正交验证质粒。将这些质粒两两组合转入E.coli TOP10中,通过外源添加不同的诱导剂,诱导相应系统的表达。根据报告基因的表达情况,对系统的正交性进行了验证。结果发现系统间仍存在信号串扰,造成该串扰的原因是EsaI产生了除3OC6HSL之外的其他非同源AHL（3OC12HSL和3OC8HSL）,激活了 Las系统。为解决这一串扰,我们对LasR蛋白进行了随机突变,构建了一个LasR突变体文库,并利用荧光筛选的方法,成功筛选到了对EsaI产生的非同源信号分子敏感度降低的突变株,消除了信号串扰。由于该突变也降低了 LasR对其同源信号分子3OC12HSL的敏感度,因此,我们进一步提高了 Las系统中3OC12HSL的合成并优化了该系统的表达,成功实现了 Las系统和Tra*系统之间的完全正交。最后,利用完全正交QS系统进行了人工基因线路的设计和构建。通过使Las系统激活Tra*系统的表达,构建了一个自诱导级联线路,实现了两个目的基因的自诱导时序表达。通过分别在蛋白表达水平和转录水平上对级联线路的功能进行验证,证实了该线路中的两个荧光报告基因可以实现自诱导时序表达。2.基于正交QS系统构建可调控种群数量比例的合成生态系统利用上述构建的完全正交QS系统作为通讯模块,以CcdA/B毒素-抗毒素系统作为效应模块,设计并构建了可以模拟自然界中竞争和共生关系的合成生态系统。在竞争生态系统中,设计了菌株CG和CR,每株菌中包含一个AHL顺式作用激活抗毒素蛋白的正反馈回路和一个AHL反式作用激活毒素蛋白的负反馈回路。其中,正反馈回路引发菌株自救行为,负反馈回路引发菌株间互相限制的行为。在共生生态系统中,设计了菌株SG和SR,每株菌中包含一个AHL顺式作用激活毒素蛋白的负反馈回路和一个AHL反式作用激活抗毒素蛋白的正反馈回路。负反馈回路引发菌株自限行为,正反馈回路引发菌株间相互救助的行为。在这两种生态系统的设计中,我们通过简单地重构通讯模块和效应模块间的布局,实现了不同生态关系的转换。基于以上设计进行菌株的构建时,通过调控每个菌株关键基因的表达,构建了一系列菌株。根据添加不同诱导剂时,各个系统中单菌株的生长状态,选择出符合预期的菌株。并通过平板共培养,将两种生态关系可视化,观察到了菌株间的竞争和共生关系。在竞争生态系统中,我们发现关键基因表达强度的不同,导致了竞争关系中优势菌株的互换。在共生生态系统中,不同的培养方式使两个菌株间的共生关系发生了改变。因此,菌株的内部表达调控和外部培养环境的不同,均可以改变生态系统中的互作关系。在对两个生态系统的设计中,每一个菌株中都有两个独立的反馈调节线路,使菌株生长的正调控和负调控之间相对独立。此外,QS系统是一种响应种群密度的诱导系统,因此,该合成生态系统具备利用生态关系调控种群比例的潜力。于是,通过进一步改造,我们构建得到了可以调控系统中种群比例关系的诱导型合成生态系统。诱导型合成生态系统是在合成生态系统的基础上,将AHL合成酶的自诱导QS启动子更换为被诱导剂激活的诱导型启动子。利用诱导剂诱导每株菌中AHL合成酶的表达,调控AHL的合成,进而控制效应模块的表达,最终实现种群比例调控的目的。通过在共培养体系中外源添加不同浓度的诱导剂,成功实现了系统中两种菌株之间的大范围比例调控。综上所述,本论文构建了一对完全正交的QS系统,扩展了合成生物学研究的工具箱;利用完全正交QS系统构建的级联线路,实现了基因的自诱导时序表达;将完全正交的QS系统应用于两种不同合成生态系统的构建中,实现了种群间数量比例的调控。