论文部分内容阅读
目的：1．检测临床大肠癌患者及正常人HGF及VEGF血清水平，并初步分析其与临床病理资料相关性及二者相关性。2．观察HGF对大肠癌细胞Lovo、SW480、Colo205粘附、迁移及侵袭能力的影响。3．检测HGF对大肠癌细胞及正常肠上皮细胞VEGF表达的影响。4．探讨MEK／ERK1／2和PI3K／AKT信号转导通路在HGF影响大肠癌细胞侵袭能力及VEGF表达过程中可能的作用。方法：1．应用ELISA方法检测大肠癌患者及正常对照者HGF、VEGF血清学水平。2．细胞培养：大肠癌细胞Lovo、SW480、Colo205及正常肠上皮细胞系按常规方法培养。3．细胞经外源性HGF处理后，应用MTT法检测Lovo、SW480、Colo205及正常肠上皮细胞粘附能力变化，Transwell小室结合倒置显微镜观察肿瘤细胞迁移能力变化，Transwell小室结合Matrix胶检测肿瘤细胞侵袭能力的变化；HGF、c-Met磷酸化抑制剂Herbimycin A(HA)、MEK／ERK1／2信号通路特异性抑制剂UO126、PI3K／AKT信号通路特异性抑制剂LY294002分别处理细胞后，检测细胞侵袭能力变化并应用ELISA及RT-PCR方法检测细胞VEGF表达变化。4．Western blot方法检测HGF、HA、UO126及LY294002处理后细胞VEGF蛋白表达水平的变化，同时检测c-Met及信号通路相关信号分子蛋白水平及磷酸化水平的变化。结果：1．大肠癌患者HGF、VEGF血清水平分别是正常人的约2.8倍、2.5倍(P＜0.01)，相关分析显示大肠癌患者血清HGF水平与临床病理分期、淋巴结转移相关(P＜0.01)，而与病理类型和分化程度无相关性(P＞0.05)；VEGF水平与病理分期、淋巴结转移、病理类型相关(P＜0.05)，而与分化程度无相关性(P＞0.05)；HGF血清水平与VEGF血清水平呈正相关(r=0.76，P＜0.01)。2．外源性HGF明显增加大肠癌细胞Lovo、SW480、Colo205粘附比率、迁移及侵袭细胞数量，40ng的HGF作用4h后，粘附细胞比率较对照组分别增加63.33％、40.63％、39.13％(P＜0.05)；24h迁移细胞数量较对照组分别增加88.05％、124.13％、127.08％(P＜0.05)；24h侵袭细胞数量较对照组分别增加101.27％、89.46％、91.82％(P＜0.05)，而正常肠上皮细胞无明显变化(P＞0.05)。c-Met磷酸化抑制剂HA、MEK／ERK1／2信号通路特异性抑制剂UO126及PI3K／AKT信号通路特异性抑制剂LY294002均显著抑制由HGF诱导的大肠癌细胞粘附、迁移及侵袭能力(P＜0.05)。3．ELISA、RT-PCR结果显示：大肠癌细胞有VEGF蛋白及mRNA转录水平表达，应用10ng、40ng、100ng HGF处理后，VEGF蛋白及mRNA转录水平均显著增加且与HGF浓度之间存在明显相关性，而正常肠上皮细胞无明显变化。HA、UO126及LY294002均显著抑制由HGF诱导的大肠癌细胞VEGF表达，HA 1.0μg、UO126合用LY294002 30μM时均几乎完全抑制HGF诱导的大肠癌细胞VEGF表达。4．Western blot结果示：大肠癌细胞c-Met表达，而正常肠上皮细胞未检测到其表达；外源性HGF诱导大肠癌细胞c-Met、ERK1／2、AKT磷酸化及VEGF蛋白表达，且与HGF剂量有关。HA降低HGF所引起的c-Met磷酸化水平，1.0μg时完全抑制HGF所诱导的c-Met磷酸化；UO126、LY294002均显著降低由HGF所诱导的大肠癌细胞ERK1／2、AKT磷酸化水平，且两者之间无交叉抑制性。结论：1．大肠癌患者HGF、VEGF血清水平高于正常人血清水平，HGF可能与大肠癌局部浸润、转移及肿瘤细胞VEGF表达有关。2．HGF可显著提高大肠癌细胞的粘附、迁移及侵袭能力，HGF促进肿瘤细胞粘附、迁移及侵袭可能与激活MEK／ERK1／2、PI3K／AKT信号通路有关。3．大肠癌细胞c-Met过表达，HGF可活化其受体c-Met，进而激活MEK／RK1／2、PI3K／AKT信号转导通路，增加肿瘤细胞VEGF mRNA转录及蛋白表达，达到促进局部血管或淋巴管增殖、增加肿瘤细胞血供、增强肿瘤细胞远处转移能力的效果。