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骨桥蛋白（osteopontin,OPN）是在骨组织中发现的一种细胞外基质蛋白,是成骨标志分子,已有研究证实其在骨髓间充质干细胞（bone-marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）的成骨过程中发挥重要的促进作用。最近又发现,OPN也高表达于包括胰腺癌在内的多种肿瘤,参与介导肿瘤的生长、转移及耐药等多种生物学行为,但OPN在胰腺癌中的作用和机制仍然存在争议。与OPN相似,转录因子Gli1在干细胞的成骨分化和胰腺癌的进展中也都发挥促进作用。Gli1是刺猬因子（Hedgehog,Hh）的下游信号分子,经典的Gli1激活机制主要通过Hh配体结合膜受体Patched（Ptch）,从而解除了Ptch对另一膜受体Smoothened（Smo）的抑制作用,后者活化后经过一系列的胞内信号转导,最终上调Gli1表达,并促使其核转位,诱导靶基因转录。然而最近有文献研究报道表明Gli1的激活可不依赖Hh配体。值得注意的是,有研究发现OPN是Gli1的靶基因,Gli1通过上调OPN表达从而促进乳腺癌、黑素瘤和肝纤维化等疾病的进展。但尚未有直接证据证实Gli1-OPN轴在胰腺癌中发挥这种调节作用;再者,已证实外胚层来源的MSCs（ectomesenchymal stem cells,EMSCs）是良好的骨修复候选种子细胞,但Gli1信号对EMSCs的成骨分化的调节作用机制尚未阐明,有待于进一步研究。本研究选取胰腺癌细胞系Bx PC-3和鼻黏膜来源的EMSCs为模型,研究Gli1-OPN轴对胰腺癌细胞和MSCs生物学行为的调节作用,并对其机制进行探讨,为临床胰腺癌的诊疗以及骨缺损病症的治疗提供实验室依据。研究分两大部分:第一部分Gli1诱导OPN表达,促进胰腺癌生物学行为一、OPN调控胰腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及干性分子表达目的:阐明OPN对人胰腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等的调节作用及机制。方法:1.免疫组化染色观察人胰腺癌组织OPN的表达,q RT-PCR、Western blot和ELISA分析胰腺癌细胞系表达和分泌OPN的水平。2.抗体阻断Bx PC-3细胞分泌OPN,以CCK-8、TUNEL和Transwell试验分别观察细胞增殖、凋亡、迁移与侵袭的变化。3.构建OPN稳定敲低表达的sh-OPN-Bx PC-3细胞,采用CCK-8、流式细胞术、TUNEL、划痕和Transwell试验分别观察增殖、凋亡、迁移与侵袭的改变,以q RT-PCR和免疫荧光观察肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）标志的变化。同时在细胞培养体系中补充重组人OPN蛋白（recombinant human OPN,rh OPN）,观察上述改变是否能逆转。4.将sh-OPN-Bx PC-3细胞接种至裸鼠皮下,观察OPN对种植瘤生长的影响。结果:1.人胰腺癌组织高表达OPN,三种胰腺癌细胞系均表达OPN m RNA和蛋白,以Bx PC-3细胞丰度最高。2.以中和抗体作阻断OPN作用,Bx PC-3细胞增殖缓慢、凋亡增多、迁移能力下降。3.敲低OPN的sh-OPN-Bx PC-3细胞增殖变慢、凋亡增加、迁移和侵袭能力都有下降,且CSC标志分子CD44、SOX2和NANOG表达水平下调;给予外源性rh OPN能部分逆转胰腺癌细胞除侵袭力外的其它生物学行为改变。4.sh-OPN-Bx PC-3细胞裸鼠体内种植成功率低、生长慢、萎缩快,瘤细胞活率不强,且免疫组化染色表明OPN阳性表达低。结论:OPN高表达于人胰腺癌组织和细胞系中,其可通过自分泌及旁分泌的方式促进Bx PC-3细胞增殖和迁移,并抑制凋亡,并维持CD44、SOX2和NANOG等CSC标志阳性群体,但对其侵袭能力影响较小。二、Hh配体非依赖的Gli1直接诱导OPN表达,促进Bx PC-3细胞的生物学行为目的:在胰腺癌细胞中研究Gli1调节OPN的表达,及其对胰腺癌生物学行为的作用和机制。方法:1.下载GEPIA数据库中来自PAAD的胰腺肿瘤的RNA测序数据,采用生物信息学对音猥因子（Sonic hedgehog,Shh）和Gli1分别与OPN m RNA表达的相关性进行分析;并以免疫组化验证胰腺癌组织中Shh、Gli1与OPN的共表达情况。采用q RT-PCR及Western blot检测Bx PC-3细胞中Shh和Gli1的表达水平。2.检测sh-OPN-Bx PC-3细胞Gli1的表达水平。再分别用Smo抑制剂环巴胺和Gli抑制剂GANT61处理Bx PC-3细胞,验证OPN m RNA和蛋白表达的变化。然后构建sh-Gli1-Bx PC-3稳转细胞,观察其OPN的表达改变,同时预测OPN启动子上Gli1的结合位点,采用双荧光素酶报告基因和Ch IP试验验证Gli1对OPN转录的直接调节。3.以rh OPN刺激sh-Gli1-Bx PC-3细胞,观察其是否可逆转Gli1敲低引起的细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和CSC标志表达的改变。4.将sh-Gli-Bx PC-3细胞接种至裸鼠皮下,观察种植瘤的生长及OPN的表达。结果:1.生物信息学分析结果表明人胰腺癌中Gli1与OPN表达具有正相关。免疫组化发现53%的胰腺癌组织中可见Gli1和OPN的共表达,Bx PC-3细胞表达Shh和Gli1的m RNA,但表达19 k D的Shh活性蛋白水平很低。2.sh-OPN仅轻微下调Bx PC-3细胞表达Gli1,而sh-Gli1则显著抑制OPN表达;GANT61也显著抑制OPN表达,但环巴胺无此作用;Gli1直接结合OPN启动子,且在敲低Gli1的胰腺癌细胞sh-Gli1-Bx PC-3中OPN启动子的富集率降低。3.sh-Gli1-Bx PC-3细胞增殖和迁移均显著受到抑制,侵袭也有抑制,细胞凋亡增多,且干细胞标志表达减少。补充rh OPN,可部分逆转其增殖、迁移、凋亡和干性分子表达的变化,但对侵袭的影响不显著。4.sh-Gli1-Bx PC-3细胞接种20天后组织全部萎缩消失,而对照组肿瘤组织生长正常。结论:非经典通路活化的Gli1可直接促进OPN的表达,并部分通过OPN促进胰腺癌细胞生长、转移,抑制细胞凋亡。第二部分Shh-Gli1信号促进鼻黏膜EMSCs的成骨分化目的:探讨经典Shh-Gli1信号对EMSCs成骨分化的调节作用,探索用EMSCs联合Shh信号治疗骨缺损性疾病的可行性。方法:1.取SD大鼠鼻黏膜作EMSCs原代培养。免疫荧光检测MSCs标志CD90、CD105、vimentin以及神经外胚层标志nestin。采用q RT-PCR和Western blot方法检测经成骨诱导第7 d的EMSCs表达Shh和Gli1的水平。2.以鼠Shh重组蛋白刺激EMSCs,成骨诱导14 d后,以茜素红染色和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性测定检测成骨反应;采用q RT-PCR、Western blot观察成骨相关蛋白OPN、骨钙蛋白（osteocalcin,OCN）、Ⅰ型胶原蛋白（collagenⅠ,COLⅠ）和Gli1的表达。3.用重组腺病毒构建过表达Shh的ad-Shh-EMSCs,并以ad-GFP-EMSCs为对照。成骨诱导14 d后,观察茜素红染色面积和ALP活性,并以q RT-PCR、Western blot和免疫荧光法观察成骨相关基因以及Gli1的表达。结果:1.原代培养的EMSCs呈成纤维细胞样,免疫荧光显示其表达CD90、CD105、vimentin及nestin。成骨诱导7 d,EMSCs表达Shh及Gli1的m NRA和蛋白水平均有升高。2.EMSCs成骨诱导14 d后,矿物化面积、ALP活性、OPN等成骨相关分子表达等指标均高于对照组;外源Shh蛋白刺激可上调上述指标;反之,用环巴胺抑制经典Shh-Gli1通路,则这些指标显著降低。3.过表达Shh的Ad-Shh-EMSCs细胞内和上清中Shh蛋白水平都显著高于ad-GFPEMSCs。成骨诱导14 d,ad-Shh-EMSCs较ad-GFP-EMSCs各项成骨指标都更明显。同样,环巴胺下调成骨指标。结论:Shh-Gli1信号促进EMSCs成骨分化,EMSCs联合经典Hh信号能促进对成骨分化,具有应用于临床骨缺损性疾病治疗的潜在价值。