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DNA双链断裂(DNA double-strand breaks, DSBs)是细胞最具毒性的DNA损伤类型之一。DNA 双链断裂主要通过同源重组(homologous recombination)和非同源末端连接(Non-homologous end joining)两条途径进行修复。同源重组修复需要一段同源序列作为模板引导损伤序列修复,产生的修复产物是相对精准。同源重组缺陷与很多疾病密切相关,包括布鲁姆综合征、维尔纳综合征、范科尼平血症以及共济失调微血管扩张综合征等。此外,同源重组的缺陷也是癌症的重要诱因之一,而且过度的重组会导致基因组不稳定。因此,同源重组对于机体应对损伤修复至关重要。同源重组修复的核心蛋白为 Rad51,Rad51 与 ssDNA 形成核纤丝对于下游链入侵以及同源序列搜索至关重要。哺乳细胞中研究发现RAD51 可以被泛素化,通过蛋白序列比对,对该蛋白泛素化位点进行了保守性分析,发现其泛素化位点在多种模式生物中进化保守。在本研究中,我以酿酒酵母为材料,对Rad51的两个保守氨基酸位点K116和 K122进行了点突变,并研究了突变蛋白对同源重组的影响及作用的分子机制,取得了如下结果:
1) 发现Rad51突变体对于多种DNA损伤药物高度敏感,说明Rad51蛋白的K116和K122位点在DNA损伤应答和修复中起重要作用。同时,我发现突变体中染色体丢失水平升高,基因组稳定性降低,说明Rad51的K116和K122位点对于维持基因组稳定性起着重要作用。
2)发现Rad51突变体对于DNA损伤后的恢复情况也存在明显缺陷。对野生型和突变体细胞进行0.01%MMS处理2小时后释放,通过细胞流式检测细胞从DNA损伤中恢复情况。结果表明:与野生型细胞相比,突变体细胞从DNA损伤中恢复进程存在明显滞后。进一步,我采用脉冲场电泳实验对细胞应答损伤的恢复情况进行了检测,发现野生型在4小时内恢复正常,而突变体细胞则不能恢 复,表明Rad51的K116和K122位点对于促进细胞DNA损伤修复本身或修复后的恢复具有重要作用。
3) 通过异位同源重组修复实验,我发现相较于野生型 80%的修复效率,突变体的修复效率显著降低,只有5%左右,这就说明Rad51的K116和K122位点能够促进同源重组修复。此外,我使用基因打靶技术,结果显示野生型细胞重组率为13%,突变体只有7%左右,重组效率显著降低,进一步验证了Rad51的K116和K122位点能够有效促进同源重组修复。
4)进一步我采用ChIP实验比较了野生型Rad51和rad51-2KR蛋白在DNA断裂处的募集情况,结果显示:相比于野生型Rad51,突变蛋白的结合量显著下降,说明rad51-2KR不能够有效的募集到DNA损伤处,这可能是突变体修复缺陷的重要原因之一,此外,我通过体外表达纯化Rad51与rad51-2KR蛋白,通过单分子实验发现,rad51-2KR在体外形成核纤丝的效率大大降低,这暗示着可能在体内rad51-2KR不能够有效的形成核纤丝,从而导致DNA损伤应答与修复的缺陷。
5)最后,我通过体外pull-down实验和体内Co-IP实验揭示了Rad51和泛素E3连接酶Bre1 存在直接相互作用,为下一步研究其互作的生理功能奠定基础。
1) 发现Rad51突变体对于多种DNA损伤药物高度敏感,说明Rad51蛋白的K116和K122位点在DNA损伤应答和修复中起重要作用。同时,我发现突变体中染色体丢失水平升高,基因组稳定性降低,说明Rad51的K116和K122位点对于维持基因组稳定性起着重要作用。
2)发现Rad51突变体对于DNA损伤后的恢复情况也存在明显缺陷。对野生型和突变体细胞进行0.01%MMS处理2小时后释放,通过细胞流式检测细胞从DNA损伤中恢复情况。结果表明:与野生型细胞相比,突变体细胞从DNA损伤中恢复进程存在明显滞后。进一步,我采用脉冲场电泳实验对细胞应答损伤的恢复情况进行了检测,发现野生型在4小时内恢复正常,而突变体细胞则不能恢 复,表明Rad51的K116和K122位点对于促进细胞DNA损伤修复本身或修复后的恢复具有重要作用。
3) 通过异位同源重组修复实验,我发现相较于野生型 80%的修复效率,突变体的修复效率显著降低,只有5%左右,这就说明Rad51的K116和K122位点能够促进同源重组修复。此外,我使用基因打靶技术,结果显示野生型细胞重组率为13%,突变体只有7%左右,重组效率显著降低,进一步验证了Rad51的K116和K122位点能够有效促进同源重组修复。
4)进一步我采用ChIP实验比较了野生型Rad51和rad51-2KR蛋白在DNA断裂处的募集情况,结果显示:相比于野生型Rad51,突变蛋白的结合量显著下降,说明rad51-2KR不能够有效的募集到DNA损伤处,这可能是突变体修复缺陷的重要原因之一,此外,我通过体外表达纯化Rad51与rad51-2KR蛋白,通过单分子实验发现,rad51-2KR在体外形成核纤丝的效率大大降低,这暗示着可能在体内rad51-2KR不能够有效的形成核纤丝,从而导致DNA损伤应答与修复的缺陷。
5)最后,我通过体外pull-down实验和体内Co-IP实验揭示了Rad51和泛素E3连接酶Bre1 存在直接相互作用,为下一步研究其互作的生理功能奠定基础。