本研究在实验组前期成果的基础上,对于挖掘出的Lr F3’5’H和Lr DFR这两个黑果枸杞黑白果中的关键差异基因,结合转基因技术进行基因功能验证。实验组前期通过分析植物表型和花青素含量在黑白果中的差异,发现花青素含量的变化引发了黑果枸杞果实出现白色变异:黑果枸杞白色果实的出现是由于其体内的花青素合成途径被阻断所导致的。经过前期大量分析,有65个黑白果花青素合成途径中的差异基因被锁定。其中27个差异基因的定量分析结果显示,调节基因与变异白果的出现无关。在结构基因中,有5个基因的转录水平呈现显著差异,说明白枸杞果中这5个基因的低表达导致了花青素的消失。DFR和F3’5’H均属于5个关键差异基因。其中,F3’5’H-c102345在黑白果中表达量差异最大,差异倍数达2391倍;同时F3’5’H作为黑果枸杞花青素合成途径中的关键酶之一,决定着黑果枸杞所积累的花青素的结构和颜色;DFR位于类黄酮生物合成途径中F3’5’H的下游,是一种起关键性作用的酶,其具备底物特异性,可以左右植物积累的花青素类型,而前两者结合能够使植物专一地积累飞燕草素。综上,本实验确定了黑果枸杞F3’5’H和DFR两个基因首先进行功能验证,主要实验结果如下:1.对于黑白两色果实中花青素的含量进行分析得出:白果花青素的含量不受发育程度影响;黑果花青素在发育前期开始积累,S4时期花青素含量到达最高,S5时期含量有所下降但也始终保持极高水平。通过对黑果枸杞不同发育阶段和不同植物器官的F3’5’H和DFR基因的表达模式分析发现,F3’5’H和DFR基因在茎、老叶和新叶中的表达低至可忽略不计。但果实中的表达量对比茎叶部位均呈现显著差异;在S3和S4时期差异尤为显著。说明黑果枸杞中的F3’5’H和DFR基因在其特定的植物器官中（果实）才有所表达,果实中的表达活性有明显差异,在S3-S4时期的表达水平最高,其表达模式具有时空特异性。2.将已有序列F3’5’H（c102345）、DFR（c92376）扩增并检测后,与公共数据库已登陆的基因序列（DFR-JN849097和F3’5’H-KY287799）进行比对,发现两者高度同源,说明已有的两个基因序列分别与Genebank中登陆的序列是同一家族的同一基因,在本实验中可以直接利用已经登录序列的起始密码子和终止密码子设计特异引物。通过上一步时空表达分析和花青素含量测定,可以确定在S3-S4时期的果实中更好捕捉到Lr F3’5’H和Lr DFR基因,将该生长时间段的果实DNA作为克隆模板,克隆全长后进行后续模式植物的转化。经过对克隆片段的检测显示成功克隆出了后续实验所需要的目的基因。在本章中对于已有片段和数据库的应用大大缩减了目的基因克隆的实验步骤,且成功率较高。3.利用Sac I和Xba I内切酶,通过双酶切手段构建p CAMBIA2300-Lr F3’5’HGFP和p CAMBIA2300-Lr DFR-GFP植物过表达载体,采用农杆菌介导法进行模式植物SR烟草的转化,利用抗生素对于转基因植株进行筛选,采用PCR技术对于转基因植株进行烟草阳性株系检测鉴定,鉴定结果表明Lr F3’5’H和Lr DFR两个外源基因均成功转入模式植物SR烟草中。4.对于转基因烟草植株花朵颜色进行观察,发现两个基因的阳性转基因烟草花朵颜色相比较野生型烟草花朵颜色均有明显加深;将野生型和阳性转基因烟草花朵的各时期花青素相对含量进行测定,对比分析发现,S1-S5时期的转基因花朵花青素含量均明显高于野生型,且含量差异在盛花期达到最大。表明外源基因成功转化至模式植物并且在烟草转基因植株中稳定表达,从而验证了F3’5’H和D FR基因对于植物花色的调控作用,显示了其基因功能。