我国农作物秸秆年产量巨大、资源丰富,但是利用率很低。同时我国饲粮严重不足,研究如何提高秸秆的营养品质对推动节粮型畜牧业和农业的可持续发展具有重要的作用。本研究从芽孢杆菌基因组中获取到两个纤维素酶基因CelA1805和CelA3258,将其转入基因工程菌乳酸乳球菌NZ9000中进行异源表达;分析重组酶酶学特性、纤维素降解机理、两个纤维素酶可能存在的协同作用以及对不同秸秆的糖化作用;研究纤维寡糖（COS）对乳酸乳球菌生长和代谢的影响;研究重组乳酸乳球菌产酶的适宜培养条件,以及在优化后的培养条件下重组乳酸乳球菌对秸秆降解的作用;研究添加不同重组乳酸乳球菌组合及剂量对油菜秸秆微贮发酵后秸秆饲料营养品质、发酵参数、秸秆微观结构及微生物菌群结构的影响,以获得重组乳酸乳球菌单独或复合添加制作秸秆微贮饲料时的最适添加量,以期阐明两种纤维素酶降解纤维的作用模式及对秸秆微贮品质的影响机理,为促进秸秆的高效利用提供一些新的理论和技术基础。试验共分为四个部分。试验一:本试验旨在构建产纤维素酶的重组乳酸乳球菌。试验选取来源于Bacillus subtilis B111和B110菌株的可能的纤维素酶基因CelA1805和CelA3258,通过NCBI网站中的Protein Blast进行同源序列比对、通过pfam网站进行结构域预测以及alphafold2在线服务器进行同源建模;分别将两个基因克隆并通过电转法转入乳酸乳球菌NZ9000中,通过含羧甲基纤维素（CMC）的平板验证其纤维素酶活,大量表达并纯化。结果表明:通过生物信息学分析,CelA1805氨基酸序列同源性为76.8%,分子量大小为52.4 KDa,属于GH8家族;CelA3258氨基酸序列同源性为99.8%,分子量大小为53.2 KDa,属于GH5家族,并含有CBM3结构域。两个Cel基因成功转入乳酸乳球菌基因组中,在表达菌株LC1805和LC3258发酵上清液中通过SDS-PAGE和Western blot鉴定出目的蛋白,与预测分子量大小一致,同时通过CMC平板进一步验证了重组乳酸乳球菌株产生了纤维素酶。以上结果表明产纤维素酶的重组乳酸乳球菌构建成功,可用于下一步试验。试验二:本试验旨在研究重组酶的酶学特性、纤维素酶水解作用模式及可能存在的协同作用。试验通过测定不同p H、温度下反应的酶活大小确定最适p H和温度,测定在不同p H、温度下保存48 h内不同时间的酶活大小来分析p H和温度稳定性;添加1 m M不同金属离子和不同浓度化学试剂与酶反应测定其对酶活的激活或抑制作用;用不同聚合度的纤维寡糖（纤维二糖-纤维五糖,G2-G5）和纯纤维底物与酶反应,通过薄层液相色谱法（TLC）确定两个酶与不同底物的水解产物;通过酶单独或共同添加分别与纯纤维底物和5种农作物秸秆反应,测定还原糖量,研究两个酶降解纤维素的协同作用及秸秆糖化作用。结果表明:（1）重组酶CelA1805和CelA3258适宜反应p H分别为4.5-7.5和4-9.5,适宜反应温度分别为4℃-55℃和4℃-70℃,p H稳定性范围分别为3-9和4.5-10.5,温度稳定性范围均为0-50℃,对纯纤维底物均具有活性。（2）CelA1805为内切型β-1,4-葡聚糖酶,CelA3258为内外切双功能纤维素酶;两个酶能水解的最小纤维寡糖分子分别为G4和G3。（3）两个酶对纯纤维底物和秸秆水解具有协同作用,协同作用比单酶作用最低可提高CMC、PASC、Avicel和滤纸的还原糖量为24.3%、8.1%、47.3%和85.2%;比单酶作用最低可提高麦秸、油菜秸、稻秸、花生秸和玉米秸的还原糖量为48.4%、55.2%、68.7%、39.4%和5.2%。由此可见,两个纤维素酶具有较好的酶学特性,能满足大部分工业生产的需求,适用于青贮和微贮的酸性条件;两者可以协同作用以提高纤维降解效率。试验三:本试验旨在研究纤维寡糖（COS）对乳酸乳球菌生长和代谢的影响、两个重组乳酸乳球菌产酶的适宜培养条件及初步验证重组乳酸乳球菌降解秸秆的效果。试验选取G、G2、CMC和两个重组酶与CMC的反应产物为碳源,分析不同碳源对乳酸乳球菌生长的OD值、活菌数和乳酸、乙酸产量的影响;选取不同培养温度、p H和时间分析两个重组乳酸乳球菌的OD值、菌落数和产酶活大小,以确定最适培养条件;单独添加或者复合添加两个重组乳酸乳球菌,并分别以玉米秸、油菜秸为底物进行液态发酵,测定p H、DMD以及乳酸、乙酸产量。结果显示:（1）两个重组酶与CMC水解产物COS均能促进乳酸乳球菌的生长,提高乳酸产量,纤维二糖的促进作用与葡萄糖相当。（2）两个重组乳酸乳球菌在最适产酶条件（30℃、p H 7.0、培养24h）下,CelA1805和CelA3258的酶活分别为0.146 U/m L和0.132 U/m L。（3）两个重组乳酸乳球菌与对照组相比降低了玉米秸和油菜秸发酵液的p H,提高了DMD和乳酸产量;其中复合菌接种效果要优于单菌接种组,复合菌组比对照组分别提高玉米秸和油菜秸DMD为37.6%（P＜0.05）和17.4%（P＜0.01）,提高乳酸产量为16.2%和23.8%（P＜0.01）。以上结果表明:重组乳酸乳球菌通过产纤维素酶降解纤维素,提高了秸秆的DMD,而水解产物中的COS促进了重组乳酸乳球菌的生长和乳酸产量。试验四:本试验分析了重组乳酸乳球菌不同添加方式和剂量对油菜秸秆微贮品质的影响,通过研究油菜秸秆微观结构的变化和微生物群落演替规律,阐明重组乳酸乳球菌调控微贮品质的机理。试验以油菜秸为发酵底物,分为LC1、LC3、LC1+3 3个处理,每个处理设1×10~7、1×10~8、1×10~9 CFU/g 3个添加水平,以自然发酵组作对照组,进行60 d微贮发酵。通过营养品质和发酵参数,选取差异最大的单菌剂组、复合菌剂组和对照组,进行SEM、FT-IR、XRD和微生物群落分析。结果显示:（1）添加重组乳酸乳球菌显著提高了油菜秸微贮饲料的CP含量,显著降低了NDF、ADF、CEL含量、p H和氨氮浓度,有提高乳酸含量的趋势,其中,添加剂与发酵天数对CP含量、乳酸含量和氨氮浓度有极显著交互效应（P＜0.01）,各处理组中以LC1+3×10~7组微贮效果最好。（2）重组乳酸乳球菌组秸秆纤维表面产生了不同程度的腐蚀、表皮脱落和撕裂,而对照组纤维表面相对光滑和完整。重组乳酸乳球菌促进了纤维素碳链中羟基、甲基和亚甲基的断裂,显著降低了秸秆纤维的结晶度,其中以复合菌处理组结晶度最低。（3）对照组富集的优势菌群主要有Proteobacteria、Weissella和Enterobacter,LC1组富集的优势菌群主要有Enterococcus和Lactobacillales,LC3组富集的优势菌群主要有Firmicutes、Lactococcus、Prevotela、Pediococcus、Bacteroides,LC1+3组富集的优势菌群主要有Agrobacterium、Sphingomonas、Devosia、Stenotrophomonas、Brevibacillus。Proteobacteria丰度与NDF、ADF和CEL含量、氨氮浓度呈显著性正相关;Enterobacter丰度与CP含量呈极显著负相关,与NDF、ADF和CEL含量、氨氮浓度、p H呈极显著正相关;Enterrococcus丰度与NDF含量、氨氮浓度呈极显著负相关;Lactococcus丰度与CP含量呈极显著正相关,与NDF、CEL含量、p H呈极显著负相关,与ADF含量、氨氮浓度呈显著负相关;Pseudomonadaceae＿Pseudomonas和Ralstonia丰度与CP含量、LA含量呈极显著正相关,与p H呈极显著负相关。以上结果表明,添加重组乳酸乳球菌进行秸秆微贮发酵,通过裂解纤维素碳链中的CH2、CH键和氢键以及降低纤维素结晶度来改变秸秆的微观结构,通过富集提高微贮品质的优势菌群的丰度来改善秸秆饲料的营养品质,其中,以LC1+3×10~7组微贮品质最好,发酵时间以60 d最好。综上所述,CelA1805具有典型的内切纤维素酶的特征,CelA3258具有内切和外切纤维素酶双功能,两者对纤维素降解具有明显的协同作用。添加重组乳酸乳球菌进行秸秆微贮,通过产纤维素酶进行酶解打破纤维素的分子结构,降低秸秆纤维的结晶度,从而降低纤维素的含量;复合添加通过调控对微贮品质相关的优势菌群的丰度来改善微贮饲料的品质。两株重组乳酸乳球菌可作为提高秸秆纤维素降解效率和改善饲料营养品质的复合微生物菌剂。