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目的:本实验研究在体外培养条件下降低小鼠体细胞的分化程度,促使其重新编程,诱导多潜能基因的表达上调,印记基因和体细胞特定基因的表达下调。
方法:用液氮反复冻融加机械振荡的方法获得细胞抽提物,制备多潜能的小鼠原始生殖细胞的抽提物;利用链球菌溶血素O(Streptolysin-O,SLO)对细胞膜的可逆透化作用对体细胞进行打孔,用倒置荧光显微镜和荧光激活细胞分选术评估SLO的最佳打孔浓度,用抽提物孵育打孔后的体细胞,CaCl2重新封膜并继续培养。Real time RT-PCR检测抽提物处理的体细胞多潜能基因和印记基因的表达;免疫荧光染色检测抽提物处理的体细胞是否表达OCT4。
结果:碱性磷酸酶鉴定有阳性表达的原始生殖细胞;结合倒置荧光显微镜和流式细胞分选技术的结果确定SLO的最佳打孔浓度为25U;使用液氮反复冻融加机械震荡的方法制备了抽提物。Real time RT-PCR检测发现多潜能的原始生殖细胞抽提物处理的体细胞培养1周和2周后,体细胞中分别检测到Nanog和Oct4的表达上调,4周后大幅上调;1周后印记基因H19和Igf2的表达下调;Lamin A的表达轻微下调。免疫荧光分析显示原始生殖细胞抽提物处理后体细胞有OCT4蛋白的表达。
结论:首次证实采用原始生殖细胞抽提物孵育打孔的体细胞,可使已分化的体细胞发生部分重编程,诱发多潜能基因的表达上调,印记基因和体细胞特定基因的表达下调。