阿帕替尼逆转肺癌细胞5-FU耐药及放疗增敏的机制研究

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研究背景及目的非小细胞肺癌的主要治疗方法是化疗和放疗。但患者化疗后易产生耐药性,放疗过程中又会产生放疗抵抗。阿帕替尼作为一种新型血管内皮生长因子受体2(VEGFR-2)的抑制剂,已经在多种肿瘤中表现出良好抗癌效果。一方面它可以通过抑制ATP结合盒转运蛋白(ABCB1,ABCG2)的外排功能来逆转肿瘤细胞的多药耐药性。另一方面,与放射治疗联合具有协同作用。因此本研究拟从两个方面探究阿帕替尼在肺癌治疗中的作用:1)阿帕替尼和5-FU联用是否具有协同作用以及阿帕替尼能否逆转非小细胞肺癌细胞对5-FU的耐药性及其机制;2)阿帕替尼对非小细胞肺癌是否具有放疗增敏性及其机制。方法1)不同浓度的阿帕替尼和5-FU单独作用以及联合作用于肺癌细胞系A549,通过MTS法分别计算两种药物抑制细胞增殖的效果,并通过计算两者的联合用药指数CI,验证其是否具有协同作用。2)先验证耐药细胞株A549/5-FU对5-FU的耐药性,然后通过MTS和细胞克隆形成进一步观察单药阿帕替尼、单药5-FU、阿帕替尼联合5-FU对耐药细胞的增殖影响;再通过流式仪测定它们对耐药细胞凋亡影响;最后再通过Western Blot实验探究逆转耐药的相关分子机制。3)将A549细胞和构建的A549肺癌裸鼠移植瘤模型设为对照组、阿帕替尼组、单纯放疗组以及联合组。在体外,通过MTS测细胞活性;免疫荧光法观察细胞核内残留的γ-H2AX焦点数量及Western Blot实验测细胞凋亡相关蛋白的表达;流式仪测细胞周期变化。在体内,观察裸鼠成瘤体积的变化并绘制相应曲线。结果1)阿帕替尼和5-FU分别对肺癌细胞株A549有细胞毒性作用,阿帕替尼联合5-FU后细胞毒性作用增强,且联合用药指数CI<1,呈协同效应。2)与亲本细胞A549相比,耐药细胞A549/5-FU对5-FU具有显著耐药性,其耐药蛋白ABCB1高表达。MTS实验和细胞克隆实验结果表明亚致死剂量的阿帕替尼(7μM)联合5-FU对肿瘤的抑制率高于单药5-FU。流式仪结果表明阿帕替尼与5-FU联合组的细胞凋亡比例明显增加。Western Blot结果显示阿帕替尼以剂量依赖性地方式下调ABCB1的表达和ERK信号通路活性来逆转A549/5-FU细胞对5-FU的耐药性。3)与阿帕替尼单药组或单纯放疗组结果相比,阿帕替尼联合放疗组降低了A549细胞的活性;联合组的细胞促凋亡蛋白PARP和cleaved caspase-3表达增多,抗凋亡蛋白Bcl-2则表达下降;联合组细胞核内残留的γ-H2AX焦点数量多于单纯放疗组,表明联合组DNA双链断裂修复过程被干扰;联合组使细胞周期阻滞于G2/M期。在小鼠移植瘤模型中,联合组能明显抑制肿瘤生长,延长裸鼠生存期。结论1、阿帕替尼对肺癌细胞株A549有抑制增殖效果,且与5-FU联用具有协同作用。二者联合应用可能成为非小细胞肺癌患者的新选择。2、阿帕替尼可以通过下调ABCB1表达和抑制ERK信号通路来逆转A549/5-FU细胞对5-FU的耐药性。3、阿帕替尼对非小细胞肺癌具有放疗增敏效应。
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