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研究目的:研究表明,内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）及线粒体损伤所致的心肌细胞凋亡在心肌梗死（myocardial infarction,MI）致病机制中发挥重要作用,依那普利临床应用中可通过改善心肌细胞重塑及心脏收缩功能明显提高MI患者的预后,进一步的研究也表明依那普利可减轻心肌肥厚大鼠的心肌细胞凋亡及内质网应激,在MI后心力衰竭中,依那普利是否发挥同样的作用?目前研究尚未见相关研究报道。另外研究发现,转化生长因子激活的激酶1（transforming growth factor-activatedkinase 1,TAK1）在MI动物模型中明显上调,且TAK1可在体内发挥抗凋亡作用,而活化T 细胞的核因子 3（Nuclear factor of activated T cells 3,NFAT3）是 TAK1 发挥作用的重要下游分子,MI后心力衰竭中TAK1/NFAT3通路起到了什么样的作用?依那普利对其是否存在调控作用?目前尚未见到相关的研究。本课题研究目的:1.观察MI后心力衰竭中是否存在线粒体损伤及内质网应激,同时研究TAK1/NFAT3通路的表达情况。2.研究依那普利是否可以抑制或减轻MI后心力衰竭的线粒体损伤及内质网应激,同时调节TAK1/NFAT3信号通路。3.研究TAK1/NFAT3通路对内质网应激、线粒体损伤及细胞凋亡的影响。研究方法:1.临床研究:比较32例心梗后心衰患者及30例年龄匹配的健康体检者心超左心室射血分数（LV ejection fraction,LVEF）及血清中的NT-proBNP含量,并通过ELISA方法检测线粒体损伤标志蛋白细胞色素C（Cytochrome C,Cyt C）及ERS损伤标志蛋白PERK的含量。2.动物实验:通过结扎小鼠心脏冠状动脉左前降支复制小鼠的心肌梗死后心力衰竭模型,模型稳定一周后再随机分成2组,每组10只,一组给予依那普利灌胃（20mg/kg.d）命名为治疗组即MI+Ena组,另一组给予等容量的生理盐水灌胃,命名为单纯MI组。同时设立假手术生理盐水组即sham组（10只）,其所有手术操作过程与MI组一致,但不结扎冠状动脉。所有组存活的小鼠按上述方法干预3周后,使用小动物心超测量心腔大小,并计算LVEF及短轴缩短率（fractional shortening,FS）,并进行比较。然后处死小鼠留取心脏标本。采用TUNEL方法检测心肌细胞凋亡程度;再采用Masson’s三色法染色,观察心肌细胞纤维化程度;另采用免疫组化方法检测cleaved caspase 3及NFAT3蛋白的表达变化;采用Western blot方法检测GRP78、ATF6、TAK1、NFAT3、Bcl-2、Bax、PARP 及 cleaved-PARP、caspase-9 及 cleaved caspase-9、caspase-3及cleavedcaspase-3等蛋白的表达含量,并使用SPSS软件进行统计学分析。3.体外细胞实验:基于糖氧剥夺培养体系即OGD模型使用原代大鼠乳鼠心肌细胞复制MI模型,采用Western blot方法检测纤维化相关蛋白Collagen Ⅰ、CollagenⅢ及α-SMA表达含量变化,同时使用依那普利干预后观察细胞凋亡相关蛋白Cleaved-PARP-1、Cleaved-casppase 9、Cleaved-casppase 3、Bax 及 Bcl-2 含量变化及TUNEL法比较细胞凋亡改变。另外检测内质网应激相关蛋白GRP78和ATF6及信号通路TAK1/NFAT3蛋白含量。设计NFAT3的siRNA抑制其表达后,观察上述纤维化相关蛋白、凋亡相关蛋白及内质网应激相关蛋白的变化。研究结果:1.临床研究结果:HF患者的LVEF（33.1±3.38%）明显低于健康对照组（63.9±3.35%）,P＜0.01;而血清 NT-proBNP 浓度（7008.5±3303.8 pg/ml）明显高于对照组（111.1±51.22pg/ml）,P＜0.01。血清ELISA结果:与健康对照组比较,心梗后心衰患者血清中CytC的含量（1.37±0.65ng/ml）明显高于对照组（0.34±0.33ng/ml）,P＜0.01;另外血清中PERK的含量（599.4±101.1pg/ml）也明显高于对照组（403.3±79.81 ng/ml）,P＜0.01。ROC曲线分析显示,当CytC浓度为0.72ng/ml、PERK浓度为535.5pg/ml时具有较高的敏感度和特异度。2.依那普利对各组小鼠心脏收缩功能的影响:小动物心脏超声发现,sham组小鼠左心室射血分数及短轴缩短率均正常（EF,83.17±5.4%;FS,,46.32±5.64%）,而MI组小鼠心功能受损严重（EF,53.76±4.07%;FS,,23.48±2.25%）,依那普利治疗后心功能明显好转（EF,68.43±5.36%;FS,33.73±3.86%;P均＜0.01）。3.依那普利对心肌纤维化的影响:小鼠动物模型的Masson’s染色显示,与MI组相比,MI+Ena组小鼠心肌纤维化面积所占比例明显减少（P＜0.01）,而sham组心肌无明显纤维化。细胞模型显示,与OGD未干预组相比,Ena组纤维化相关蛋白Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 及 α-SMA 明显下调（P均＜0.05）。4.依那普利对心肌细胞凋亡的影响:动物模型:TUNEL染色结果显示,MI组小鼠中心肌细胞中凋亡小体明显增多,而MI+Ena组较MI组凋亡小体明显减少（P＜0.01）,sham组未发现凋亡小体存在;免疫组化染色结果显示,cleaved-caspase-3在MI组染色明显增强,MI+Ena组染色减少,sham组未发现染色;Western blot结果显示,与 sham 组比较,cleaved-PARP、cleaved-caspase-9 及 cleaved-caspase-3 等凋亡蛋白含量在MI组中明显升高（P均＜0.01）,而MI+Ena组治疗后明显下降（P均＜0.01）。细胞模型:Western blot结果显示,与OGD未干预组比较,Ena组Cleaved-PARP-1、Cleaved-casppase9、Cleaved-casppase3、Bax 蛋白表达水平明显下降,而 Bcl-2表达则明显上升（P＜0.05）。TUNEL染色也显示,Ena可明显减少心肌细胞凋亡。5.依那普利对心肌细胞ERS的影响:动物模型:Western blot结果显示,与sham组比较,ERS相关蛋白GRP78和ATF6在MI组明显上调（P＜0.05）,而在MI+Ena组中较MI组明显下调（P＜0.01）。细胞模型:Western blot结果显示,与OGD未干预组比较,Ena处理能够显著降低ERS相关蛋白GRP78和ATF6的表达水平（P＜0.05）。6.依那普利对心肌细胞TAK1/NFAT3信号通路的影响:动物模型:Western blot结果显示,与sham组比较,磷酸化的TAK1在MI组明显升高（P＜0.05）,而在MI+Ena组中升高更加明显（P＜0.05）。NFAT3的蛋白含量与TAK1相似,即在MI组中较sham组高（P＜0.05）,使用药物治疗的MI+Ena组含量更高（P＜0.05）;免疫组化也显示,NFAT3的蛋白在MI组较sham组染色增强,而MI+Ena组蛋白染色最强,sham组无明显染色。此外,Western blot结果表明MI+Ena组细胞核NFAT3的含量明显高于MI组（P＜0.05）,说明其核转位增强。细胞模型:Western blot结果表明,与对照组相比,磷酸化的TAK1在OGD组明显升高,而在OGD+Ena组中升高更加明显。NFAT3的蛋白含量与TAK1相似,即在OGD组中较对照组高,使用Ena处理的OGD组含量最高。此外,OGD+Ena组NFAT3核转位明显高于OGD组。P均＜0.05。7.干预TAK1/NFAT3信号通路后对心肌细胞的影响:使用siRNA抑制NFAT3表达后,Western blot结果显示,Ena抑制纤维化相关蛋白(CollagenⅠ、Collagen Ⅲ及α-SMA 表达、抑制促凋亡因子 Cleaved-PARP-1、Cleaved-casppase9、Cleaved-casppase 3及Bax蛋白表达、抑制内质网应激蛋白GRP78和ATF6表达的作用均被逆转。TUNEL染色也显示,抑制NFAT3表达后心肌细胞凋亡明显增加。研究结论:1.心梗后心衰患者存在ERS及线粒体损伤。2.依那普利可通过改善心肌纤维化及提高心脏收缩功能发挥治疗作用。3.依那普利在MI后心衰中的治疗作用可能是通过降低线粒体损伤及ERS所致的细胞凋亡而实现的。4.依那普利减少心肌细胞纤维化、降低线粒体损伤及ERS的作用可能是通过上调TAK1/NFAT3信号通路,并促进NFAT3的核转位而发挥的。