第一部分　　格特隐球菌是临床上主要的致病真菌之一，多侵犯免疫正常人群，通常会引起肺部感染疾病，而新生隐球菌多侵犯免疫抑制人群，一般会引起脑膜脑炎。虽然格特隐球菌和新生隐球菌归属于不同的菌种，其感染所致隐球菌病致死率都非常高。　　去泛素化在蛋白质修饰中起着至关重要的作用，去泛素化酶主要负责介导泛素的移除和回收，参与调控细胞周期、基因表达等多种细胞活动。在以往的研究中，我们发现新生隐球菌中去泛素化酶Ubp5的缺失会导致生长缺陷和高温耐受、荚膜生长和黑色素分泌等毒力显著下降，提示去泛素化酶Ubp5参与了新生隐球菌生长与毒力的多效性调控。为了探索Ubp5在格特隐球菌和新生隐球菌中作用的不同，我们以格特隐球菌为背景构建了基因UBP5的基因缺陷株，检测基因UBP5的缺失对格特隐球菌生长、高温、各种应激应答反应的敏感性和体内毒力的影响。实验结果显示格特隐球菌和新生隐球菌的UBP5基因缺陷株R265ubp5Δ和H99 ubp5Δ表现出了一些相似的表型。首先是两者在营养正常和营养缺乏条件下都表现出了严重的生长缺陷。根据以往的研究我们知道去泛素化酶CnUBP5的同源蛋白Ubp15参与了S.cerevisiae的细胞增殖速率的调控而CnUBP5也相似的调控了某些与细胞周期有关基因的转录。新生隐球菌和格特隐球菌UBP5基因相似的生长缺陷引导我们推测去泛素化酶Ubp5可能在格特隐球菌细胞增殖调控中发挥着与新生隐球菌中相似的作用。基因缺陷株R265ubp5Δ和H99 ubp5Δ表现出相似的高温敏感性，提示两个菌种高温耐受调节的保守性。以往的研究表明泛素系统在新生隐球菌种参与了抗真菌药物敏感性的调控，而新生隐球菌和格特隐球菌展示了对抗真菌药物相似的敏感性。[1]在我们的研究中，我们发现与野生株和回复突变株相比，格特隐球菌中去泛素化酶Ubp5的基因缺陷株对两性霉素B，氟康唑，氟胞嘧啶，伊曲康唑，特比萘酚和伏立康唑的敏感性都显著增强。而回复突变株能够回复表型进一步证实UBP5可能参与了格特隐球菌和新生隐球菌的耐药机制调控。格特隐球菌基因缺陷株R265ubp5Δ表现出对细胞壁应激的高度敏感性，这和新生隐球菌的基因缺陷株是一致的。令人意想不到的是，Ubp5对黑色素合成和荚膜生成的影响是完全不同的。在L-DOPA培养基上30℃条件下孵育5天后基因缺陷株C.gattii ubp5Δ黑色素产生比野生株略有增强。在咖啡酸培养基上我们也观察到了更为显著的黑色素分泌差异。去泛素化酶基因UBP5的敲除增强了格特隐球菌中荚膜的合成。这些数据证明了去泛素化酶Ubp5在格特隐球菌中荚膜和黑色素合成中重要的调控作用。　　我们分别用小鼠吸入模型和Caenorhabditis elegans模型做了体内毒力实验，对比了基因缺陷株R265ubp5Δ，野生株和回复突变株毒力的不同。在小鼠吸入模型中，基因缺陷株感染的小鼠能够存活80天以上，而且肺组织中的真菌负荷量显著低于野生株，脑组织或脾脏组织甚至没有发现酵母细胞的存活。有趣的是，我们发现在感染后80天内，基因缺陷株感染小鼠肺组织的真菌负荷量是呈下降的趋势，而且到了第56天肺组织中的酵母细胞已经被完全清除了。与之形成鲜明对比的是，野生株感染小鼠的肺组织真菌负荷量在感染后8周内一直维持在稳定的水平。格特隐球菌中的回复突变株能够完全恢复隐球菌的毒力，这与以往研究中报道的新生隐球菌回复突变株的不完全恢复毒力是不同的。这个实验结果表明，尽管感染格特隐球菌的患者主要表现为肺部感染，但是格特隐球菌的酵母细胞是可以通过血脑屏障而且存活的。这与既往的研究是相一致的[2]。另外一方面，基因UBP5的敲除也导致了酵母细胞在肺组织完全的清除，这可能最终导致了脾脏和脑组织中真菌负荷量为零。这个结果提示，去泛素化酶Ubp5可能在抑制宿主免疫系统或者介导毒力调控中发挥着关键的作用。　　综上所述，我们的研究证实了去泛素化酶Ubp5参与多效调控格特隐球菌的生长与毒力，同时我们通过对比格特隐球菌和新生隐球菌Ubp5基因缺陷株的表型，发现Ubp5在格特隐球菌和新生隐球菌中调控多种应激应答反应具有相似性，但是对荚膜生成和黑色素合成的影响则差异很大，这进一步证明了两者在进化上的保守性和差异性，为临床上更有靶向的研究两者的致病机制提供了证据和思路。　　第二部分　　除了上述研究的高温耐受、荚膜等经典毒力，研究证实真菌的形态对真菌在人体内生存也至关重要。最近研究者发现新生隐球菌在菌丝相毒力显著下降，这也和大多数临床株以酵母相存在是一致的。为此我们又探索了与酵母相-菌丝相互相转换机制有关的影响因素。　　表观遗传参与所有真核生物中基因表达等很多细胞活动，研究证明表观遗传对菌丝生成具有调控作用[3]。PHD结构域(Plant homeodomain)是一种重要的表观遗传控制因子[4]，目前研究主要集中在PHD结构域的结构学分析，对其生物学功能尤其在真菌中鲜有涉及[5]。本研究中我们选择PHD结构域作为研究表观遗传和新生隐球菌酵母相-菌丝相酵母相-菌丝相转换机制关系的切入点。　　我们选择新生隐球菌血清D型JEC21标准株来进行生物信息学研究，主要是因为JEC21注释比较完善而且是研究有性繁殖和菌丝生长的常用模式菌株。我们首先检测了PHD基因在真菌细胞生长指数期的转录水平，结果显示其转录水平比内参基因显著降低，这说明PHD基因在细胞生长过程中可能不起作用或者没有起到关键性的作用，但也不能排除转录因子普遍表达水平较低的原因。为了探索PHD基因在有性交配中是否发挥重要作用，我们检测了不同配型α和a异性交配过程中PHD基因在不同时间点(0h，3h，10h，24h，48h，72h)的转录水平。结果显示只有PHD4出现表达水平显著上升，据此我们可以推测可能PHD4在有性生殖中起到至关重要的作用，可以作为我们研究的重点。　　为了系统研究这些Phd蛋白在新生隐球菌菌丝生成的调控作用，我们构建了所有PHD基因的缺陷株，然后通过与野生株对比来研究他们在体外应激应答反应和菌丝生成调控中的作用。我们选取XL280作为背景株，因为它是JEC21的直系后代，基因序列具有高度同源性，是近几年研究新生隐球菌有性生殖和菌丝生成的模式菌株，综合考虑有利于我们进行生物学分析和实验设计。　　我们检测了所有基因缺陷株对高温、NO、氧化应激、营养匮乏等体外应激应答反应，结果显示只有phd3Δ和phd15Δ基因缺陷株具有明显的生长缺陷。我们又观察了基因缺陷株对荚膜生成和黑色素合成的影响，比野生株对比，均未发现明显异常。综上所述，我们可以得出，大部分PHD基因不参与以上经典应激应答和毒力因素的调控，因此可以一定程度上排除这些因素对菌丝生成的影响。　　本课题成员在以往的研究中发现znf1Δ和phd13Δ基因缺陷株在有性繁殖中菌丝生成增多，为了探究是否是由于PHD结构域功能的缺失导致了菌丝生成增多，我们对所有PHD基因缺陷株进行异性交配和同性交配实验，观察在此过程中菌丝生成情况。结果显示，同性交配过程中，phd2Δ，phd11Δ，phd13Δ和znf1Δ基因缺陷株的菌丝生长显著增强。说明Phd2，Phd11，Phd13和Znf1对菌丝生成是负向调控的作用，我们推测Phd2，Phd11，Phd13和Znf1蛋白可能参与了同性交配过程中抑制菌丝生长的调控因子表达的激活。异性交配实验中，我们利用JEC20a与缺陷株（α）交配来检测基因缺陷株对异性交配过程中菌丝生长的影响。我们选用JEC20a是因为它自生菌丝的能力很弱，因此可以排除自生菌丝对异性交配实验结果的影响。令人意想不到的是，phd2Δα×JEC20a异性交配中我们观察到菌丝生成是减弱的，这与我们在同性交配中观察到的现象完全相反。而对phd13Δandznf1Δ基因缺陷株来说，我们观察到一个有趣的现象，随着孵育时间的延长，基因缺陷株同性交配中的菌丝生长比野生株显著减弱。这个结果引起我们的推测，Phd13和Znf1可能只是在早期阶段参与外激素应答的抑制。　　相比之下，在同性交配和异性交配中基因缺陷株phd3Δ，phd15Δ和phd12Δ都表现出菌丝生成的缺陷。对基因缺陷株phd3Δ和phd15Δ来说，这种菌丝生长缺陷可能是由其生长缺陷造成的，因为在室温下他们的生长情况也较野生株差很多。Phd12则与之不同，更可能会参与到菌丝生长调控过程。　　综上所述，我们的研究证实了植物同源结构域(Plant homeodomain)对新生隐球菌酵母相-菌丝相酵母相-菌丝相调控的影响，并进一步探索了Phd蛋白在有性生殖过程中调控菌丝生成的可能机制，同时我们研究发现大部分Phd蛋白不影响新生隐球菌多种体外应激应答与毒力，进一步证实了Phd蛋白特异性参与菌丝生成调控的可能性。