【摘 要】
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多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,P.multocida）主要分为A、B、D、E和F五种血清型,其中A型多杀性巴氏杆菌常在鸡群中引起禽霍乱（Fowl cholera,FC）。禽霍乱呈现以出血性败血症和肝急性坏死为典型特征的病理变化,死亡率高,对养禽业的经济产生巨大的冲击。细胞焦亡是一种常伴炎症反应的程序性死亡方式,具有重要的研究意义。目前研究P.multocida感染禽类
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多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,P.multocida）主要分为A、B、D、E和F五种血清型,其中A型多杀性巴氏杆菌常在鸡群中引起禽霍乱（Fowl cholera,FC）。禽霍乱呈现以出血性败血症和肝急性坏死为典型特征的病理变化,死亡率高,对养禽业的经济产生巨大的冲击。细胞焦亡是一种常伴炎症反应的程序性死亡方式,具有重要的研究意义。目前研究P.multocida感染禽类致肝脏损伤的机制主要集中于炎症、细胞凋亡和坏死性凋亡,而细胞焦亡是否参与肝损伤过程尚不清楚。因此,本研究探讨了细胞焦亡在P.multocida致肉鸡肝损伤模型中的发生情况和作用,为临床禽霍乱的肝损伤修复提供理论参考。本研究将试验鸡随机分为感染组和对照组,感染组每羽脚蹼注射P.multocida菌液的总菌量为8.75×10~5CFU,对照组注射等体积的无菌生理盐水,分别于处理后动态剖检采集组织样品,观察肝组织病理变化,并用免疫组织化学方法检测肝组织焦亡相关蛋白的表达情况。鸡感染P.multocida 12h后剖检发现肝体积开始增大,感染24h后表面密布大量针尖至粟粒大小灰白色的坏死点,镜下可见肝小叶内存在大小不均的凝固性坏死灶,坏死区域可见崩解的肝细胞,胞核破碎或溶解,伴有大量的异嗜性粒细胞浸润。免疫组化结果显示,肝组织坏死区域焦亡相关蛋白Caspase-1、GSDMD和NLRP3的表达量极显著增加（P＜0.01）。为了进一步验证在多杀性巴氏杆菌感染后肝细胞是否发生细胞焦亡,本研究拟采用鸡原代肝细胞进行体外试验。为获取最佳状态的原代肝细胞,采用剪碎法和半原位灌流法分离培养1日龄、15日龄、30日龄和成年鸡的原代肝细胞。结果显示,30日龄和成年鸡采用半原位灌流法分离得到的细胞纯度高、数量多且状态良好,适合进行体外试验研究。同时对原代细胞进行油红O染色、PAS染色、免疫组织化学染色和间接免疫荧光染色鉴定,结果表明分离的细胞具备分泌糖原和储存脂质的功能,证实分离的细胞即为肝细胞。选择细胞焦亡的经典途径,即NLRP3/GSDMD/Caspase-1信号通路,检测感染P.multocida后肉鸡肝组织和肝细胞的焦亡相关因子。选取30日龄肉鸡的原代肝细胞进行体外试验,P.multocida以浓度为7.00×10~7CFU/m L,每孔1m L,感染生长至70%-80%的原代肝细胞,分别于感染后6h、12h、24h收集上清液和细胞,检测细胞上清的LDH含量发现感染组LDH含量显著升高,在感染6h和12h时显著上调（P＜0.05）,在感染24h时极显著上调（P＜0.01）,表明原代肝细胞受到损伤。对收集的肉鸡肝组织和原代肝细胞,采用q PCR和ELISA方法检测焦亡相关因子的转录水平和表达水平。q PCR检测结果显示,与对照组相比,感染组肝组织NEK7、Caspase-1、IL-18和IL-1β的转录水平均上调,在感染12h、36h和48h时极显著上调（P＜0.01）,NLRP3的转录水平普遍降低;而感染组原代肝细胞NEK7、NLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1β的转录水平均上调,其中NEK7的转录水平在感染12h时极显著上调（P＜0.01）,NLRP3的转录水平在感染6h和24h时极显著上调（P＜0.01）,Caspase-1的转录水平在感染6h和12h时极显著上调（P＜0.01）,IL-18和IL-1β的转录水平均极显著上调（P＜0.01）。ELISA检测结果显示,与对照组相比,感染组肝组织和原代肝细胞IL-1β和IL-18的表达量均上调。Western Blot检测结果显示,与对照组相比,感染组肝组织NLRP3蛋白表达量在12h和24h时极显著下降（P＜0.01）,在36h和48h时极显著上调（P＜0.01）,而GSDMD蛋白表达量在感染12h、24h和36h时均极显著上调（P＜0.01）。以上结果表明,细胞焦亡参与P.multocida感染导致的肉鸡肝损伤。采用半原位灌流法分离培养的30日龄肉鸡和成年肉鸡的原代肝细胞状态最佳。肉鸡感染P.multocida后肝脏出现了典型的病变,且通过体内和体外试验发现细胞焦亡参与了P.multocida感染导致的肉鸡肝损伤。
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