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研究背景及目的ASD病因复杂,近年来,随着对ASD研究的不断深入,在ASD的发病机制、诊断和干预治疗等方面的研究都取得了新的突破性进展。自闭症在临床治疗手段主要是心理干预结合药物治疗的方式,由于缺乏治疗自闭症核心症状的药物,治疗ASD的药物不良反应较多且预后效果尚不十分明显；训练干预的方式也由于缺乏循证医学的依据治疗效果不佳。嗅觉是动物发育最早最重要的感觉之一,嗅觉通路与许多功能性脑区联系密切,参与调节情绪和学习记忆等行为,嗅觉通路的损坏与许多疾病的发生有关联。嗅觉通路参与海马、杏仁核、下丘脑、梨形皮质、内嗅皮质和纹状体等脑区的神经递质的调节。以往研究发现,芳香物质含有丰富的挥发油,可通过嗅觉通路作用于中枢神经系统,可用来作为干预治疗或辅助治疗神经系统疾病的新手段。研究显示辛夷的挥发油活性成分具有祛风散寒、改善局部血液循环、抑菌抗病毒、收敛等作用。嗅觉通路能否对自闭症这类的中枢神经系统疾病是否有影响?芳香小分子物质通过吸嗅的给药方式作用于自闭症,能否起到理想的干预治疗作用?其作用机制是什么?本实验通过研究辛夷挥发油活性成分对自闭症模型昆明鼠的学习记忆行为的影响,探讨通过嗅觉通路给药途径对于自闭症干预治疗的效果和机制。第一部分自闭症昆明鼠模型的制备及评价方法采用丙戊酸钠制备自闭症昆明鼠模型,在孕期的12.5d腹腔注射VPA600mg/kg,根据其生理发育期(10w内)的体质量变化和其他生理发育指标来评价自闭症模型制备是否成功。实验共分为三组,模型组、吸嗅组和正常组。结果孕期昆明鼠注射VPA后,对出生后各组仔鼠的生理发育指标进行记录并比较,与正常组相比,模型组昆明鼠在体质量增长方面明显慢于正常组,且其他生理发育指标如上下门齿长出时间、睁眼时间、睾丸下降时间等都晚于正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分自闭症模型昆明鼠神经行为学研究方法神经行为学研究包括旷场实验、交流障碍实验、社会交往实验和抑郁样行为实验。旷场实验测定小鼠在新奇环境中的运动探索行为；交流障碍实验反映其对社交气味的识别情况；社会交往实验检测其和同伴的社会互动交往行为；抑郁样行为实验则反映出其对绝望环境的逃离欲望。结果与正常组相比,旷场实验中模型组穿格子数和直立次数明显减少(P<0.05),模型组小鼠的排便粒数和自我修饰的次数明显大于正常组,结果有显著性差异(P<0.05)；交流障碍实验中,两组小鼠对社交气味的吸嗅时间(P<0.05)显著大于对非社交气味的吸嗅时间,且模型组(13.57±4.04)对社交气味的吸嗅时间明显小于正常组(25.87±4.64),结果有显著性差异(P＜0.001)；在社交行为实验中,与正常组相比,模型组小鼠跟随同伴、与同伴身体接触及区域探视的次数明显减少,结果有显著性差异(P＜0.001),而自我修饰次数则未见显著性差异(P＞0.05)；抑郁样行为实验结果显示,模型组小鼠强迫游泳实验(FST)和悬尾实验(TST)的累积不动时间(80.2±24.34)明显大于正常组,结果有显著性差异(P＜0.05)。第三部分辛夷挥发油经嗅觉通路改善自闭症模型昆明鼠学习记忆能力方法神经行为学实验结束后,吸嗅组小鼠给予辛夷挥发油连续吸嗅处理,连续干预2w,干预后各组小鼠分别进行Morris水迷宫实验,检测各组小鼠的学习记忆能力和空间探索能力。观察辛夷挥发油吸嗅对自闭症模型昆明鼠学习记忆行为的影响。结果定位航行阶段,模型组和正常组的逃避潜伏期随着训练天数的增加而缩短,模型组的逃避潜伏期明显长于正常组和吸嗅组(p＜0.05)；在空间探索阶段,模型组(8.12±2.66)穿平台次数少于吸嗅组(12.2±3.25)和正常组(14.30±3.66),结果有显著性差异(P＜0.05)。第四部分辛夷挥发油干预后脑组织神经形态学变化及脑内5-HT和DA变化方法通过Morris水迷宫实验显示出经辛夷挥发油吸嗅后,自闭症模型昆明鼠的学习记忆能力得到显著提高。为探索辛夷挥发油的作用机制,通过HE染色和免疫组化方法检测海马、杏仁核和下丘脑区域5-HT和DA蛋白表达的变化。并通过对各脑区的进行图像分析,测定各脑区内5-HT和DA阳性反应产物的平均光密度。结果HE染色结果显示,正常组细胞数量最多,排列整齐,结构清晰；模型组细胞数量最少,形态不规则,且结构不清晰；吸嗅组细胞数量较多,结构较清晰。免疫组化染色结果显示,正常组各脑区5-HT和DA的免疫反应最强,免疫反应产物为棕褐色颗粒,排列紧凑；模型组5-HT和DA免疫反应最弱,细胞数量较少；吸嗅组免疫反应适中,细胞数量较多细胞着色较深,排列较紧凑。结论1.嗅觉通路与中枢神经系统疾病密切相关。2.辛夷挥发油经嗅觉通路可改善自闭症模型昆明鼠的学习记忆能力,其机制可能与脑区内5-HT和DA的表达增高有关。