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第一部分:金银花有效成分的分析 目的:对金银花中主要有效成分进行分析。 方法:高效液相色谱(HPLC)法测定金银花中绿原酸的含量,选用VP-ODS C18色谱柱(150mm×4.6mm),乙腈-0.4％磷酸溶液(13:87)为流动相,检测波长为327nm;照紫外-可见分光光度(UV-VIS)法,500nm波长处测定金银花溶液的吸光度,以芦丁为对照品,计算金银花中总黄酮的含量;HPLC法测定金银花中木犀草苷的含量,选用VP-ODS C18色谱柱(150mm×4.6mm),乙腈为流动相A,0.5%冰醋酸溶液为流动相B,按A(%)10→30,B(%)90→70,在0~30min内梯度洗脱,检测波长为350nm。 结果:绿原酸进样量在0.2~1μg范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系(r=0.9996),金银花中绿原酸含量为2.72%。芦丁浓度在8~40μg/ml范围内与吸光度呈良好的线性关系(r=0.9998),金银花中总黄酮含量为6.46%。木犀草苷进样量在0.08~0.4μg范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系(r=0.9995),金银花中木犀草苷含量为0.065%。 结论:绿原酸和总黄酮都是金银花的主要有效成分。 第二部分:山银花有效成分的提取以及抑制巨噬细胞胆固醇蓄积作用的研究 目的:考察山银花提取物抑制巨噬细胞胆固醇蓄积的作用。 方法:运用中药提取分离技术,得到山银花的乙醇提取物,按照溶液极性大小的不同,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相等不同的组分。以石油醚相(药物1)、乙酸乙酯相(药物2)、正丁醇相(药物3)作为受试药物。体外培养鼠源性巨噬细胞(RAW264.7细胞),不同浓度的脂肪乳(20%脂肪乳与培养基比例分别为0:1、1:6、1:5、1:4、1:2、1:1)孵育RAW264.7细胞,再以最佳浓度脂肪乳孵育细胞不同时间(0、3、6、12、24、48h),油红 O染色法观察细胞荷脂情况。进一步实验将细胞分成5组,即正常组、荷脂组(10%脂肪乳组)、10%脂肪乳+药物1组、10%脂肪乳+药物2组、10%脂肪乳+药物3组,油红O染色法观察细胞内脂粒变化,Western印迹法检测小凹蛋白-1(caveolin-1)的表达,反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测SREBP-1的mRNA表达。 结果:油红 O染色显示,在一定浓度和时间范围内,细胞中脂粒随脂肪乳浓度升高和荷脂时间的延长而增多,10%脂肪乳荷脂24h使细胞荷脂情况最佳;不同因素处理细胞24h,油红O染色显示,药物1组、2组、3组均使荷脂细胞的脂粒减少,且药物2组使脂粒减少最明显。Western印迹结果显示,荷脂组较正常组 caveolin-1表达下调,药物1、2、3组caveolin-1的表达均较荷脂组有上调趋势,且药物2组上调最明显;免疫荧光检测显示,与荷脂组比较,药物1、2、3组能上调caveolin-1表达,且药物2组上调最明显。RT-PCR结果显示,荷脂组较正常组SREBP-1的mRNA表达上调,药物1、2、3组SREBP-1的mRNA表达均较荷脂组下调。 结论: 1.山银花提取物(药物1、2、3)具有抑制巨噬细胞胆固醇蓄积的作用,且药物2的作用较强; 2.山银花提取物抑制巨噬细胞胆固醇蓄积的作用可能与上调 caveolin-1表达有关; 3.药物可能通过抑制SREBP-1的表达而上调caveolin-1的表达。