研究背景:银屑病（Psoriasis）为皮肤科多见的与免疫相关的慢性易复发的炎症性疾病,导致银屑病的病因及发病机制仍不十分明了,根据目前研究进展,学者们一致认为IL-23/Th17轴在其发生发展中起着举足轻重的作用。白细胞介素（interlukin,IL）-23是促炎因子,主要是由树突状细胞（dendritic cells DCs）分泌的,辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）是由辅助性T细胞分化的,并可以释放IL-17等因子,在这一过程中,促炎因子IL-23发挥着重要作用。IL-23/IL-17信号轴抑制剂治疗银屑病疗效显著,表明IL-23/Th17轴是治疗银屑病的良好靶点。现在临床上医治银屑病的主要方法有外涂药物疗法、光学疗法、传统的系统药物疗法、生物制剂以及小分子靶向药疗法。然而,部分患者经上述疗法治疗后,依然不能达到十分满意的治疗效果,因此,在银屑病研究领域,探索研发新的治疗方法依然是研究热点。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在临床上应用10多年,其具有强大的免疫调节作用,对免疫相关疾病有良好医治效果。先前临床报道中证明同种异体MSCs能够减轻银屑病患者的临床症状。人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSCs）作为新的MSCs来源,具有很强的自我更新、多向分化及免疫调节的潜能,另外亦具备低免疫原性、非创伤性获得等优点,所以,hucMSCs在细胞疗法当中是一种拥有巨大应用潜能的细胞。伴随对外泌体认识水平的提高,逐渐认识到MSCs衍生的外泌体（exosomes）与其治疗作用密切相关。外泌体是一种纳米囊泡（50～200 nm）,可来源于大多数活的细胞,在细胞之间传递信息方面起着重要的作用。MSCs衍生的外泌体（mesenchymal stem cells exosomes,MSCs-Exo）可以基本囊括MSCs的功能。有研究报道MSCs-Exo可减轻炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）、特应性皮炎（atopic dermatitis,AD）动物模型的炎性反应。银屑病与AD、IBD均属于免疫相关的炎症性疾病。然而,MSCs-Exo在银屑病中的作用机制很大程度上仍不明确,本课题的研究目的通过提取hucMSCs-Exo,对hucMSCs及hucMSCs-Exo进行鉴定;并与DCs、HaCat细胞共培养以探讨hucMSCs-Exo抑制银屑病样炎症的作用机制;同时构建银屑病样小鼠模型,观察人脐带间充质干细胞外泌体（human umbilical cord mesenchymal stem cells exosomes,hucMSCs-Exo）是否能减轻银屑病样小鼠的炎症反应。第一部分:人脐带间充质干细胞鉴定及其外泌体的提取、鉴定及摄入为确保实验结果的准确性及一致性,我们整个实验所用的hucMSCs均为第3代hucMSCs,所提取的hucMSCs-Exo均从第3代hucMSCs中获得。研究目的:1.对hucMSCs的表型及分化潜能进行判定,明确hucMSCs是否具有干细胞的性状。2.提取hucMSCs-Exo,对制备好的hucMSCs-Exo进行鉴定及浓度测定,明确我们所获得hucMSCs-Exo是否具有外泌体的特性,以便确保后续实验可以顺利进行。3.观察hucMSCs-Exo是否可以被人类永生化的角质形成细胞（human immortalized keratinocytes,HaCat）所摄取,为后续的细胞实验及动物实验提供依据。研究方法:1.HucMSCs鉴定:1)采用流式细胞术检测hucMSCs特异性表面标记,如阳性标记CD29、CD44、CD105及阴性标记HLA-DR;2)对hucMSCs诱导分化实验,成脂方向诱导分化2w、成骨方向诱导分化3w,依次实施油红O染色实验、茜素红染色实验鉴定其分化情况。2.HucMSCs-Exo鉴定:1)汇集生长状态优良的hucMSCs上清液,采用超高速离法提取 hucMSCs-Exo;2)使用透射电镜（transmission electron microscope,TEM）观测hucMSCs-Exo大小和形状;3)采用蛋白免疫印迹法（Western Blotting）对hucMSCs-Exo特异性标记进行检测,如阳性标记CD9、CD63、CD81、TSG101及阴性标记GAPDH;4)采用纳米粒子追踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）法检测 hucMSCs-Exo的直径和粒子浓度;5)采用BCA蛋白检测产品测验hucMSCs-Exo的浓度大小。3.HucMSCs-Exo摄入:将制备标记好的hucMSCs-Exo与HaCat细胞一起养育12小时,使用共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope,CLSM）下查看hucMS Cs-Exo摄入情况。研究结果:1.HucMSCs:1)形态:在倒置显微镜下观察,hucMSCs大小、形态均匀,细长纺锤状,涡旋状贴壁状态;2)经流式细胞术检测发现CD29、CD44、CD105等阳性表面标志物均在hucMSCs细胞上高表达,而HLA-DR阴性表面标志物则低表达;3)经诱导分化结果显示:成骨诱导实验结束,经茜素红染色实验观察到,hucMSCs细胞间可见边界清楚的橘黄色结节;成脂诱实验结束,通过油红O染色显示hucMSCs细胞间有多处簇状分布的油脂滴。2.HucMSCs-Exo:1)形态:通过TEM可以看到,hucMSCs-Exo呈杯型或圆形,胞膜完整;2)Western Blotting检测发现hucMSCs-Exo显著表达四跨膜蛋白TSG101、CD81、CD63、CD9,hucMSCs 细胞未见明显表达;GAPDH 在 hucMSCs-Exo 低表达,而在hucMSCs细胞中高表达;3)经NTA检测发现hucMSCs-Exo直径主要集中在55～167nm之间,颗粒浓度约为2.3*1011 Particles/mL;4)BCA试剂盒测定hucMSCs-Exo的蛋白浓度约为0.3～0.5μg/μl。3.HucMSCs-Exo摄入:将制备好的hucMSCs-Exo同HaCat细胞一起培育12小时后,在CLSM下观察到hUCMSCs-Exo较多的聚集在HaCat细胞内及细胞核周围。结论:1.HucMSCs细胞呈细长纺锤状,涡旋状贴壁状态;高表达CD29、CD44、CD105,低表达HLA-DR;有向着成骨及脂肪细胞分化的潜力。2.HucMSCs-Exo呈圆形或杯型,胞膜完整;高表达TSG101、CD81、CD63、CD9,低表达GAPDH;直径主要集中在55～167nm之间,颗粒浓度约为2.3*1011 Particles/mL;蛋白浓度约为0.3～0.5μg/μl。3.HaCat细胞可成功摄取hucMSCs-Exo。第二部分:HucMSCs-Exo抑制树突状细胞成熟活化及角质形成细胞炎症因子分泌的作用机制研究研究目的:1.探索hucMSCs-Exo与DCs、HaCat细胞共培养的最佳浓度。2.探讨hucMSCs-Exo是否抑制DCs的成熟、活化及其促炎因子IL-23的分泌。3.探讨hucMSCs-Exo是否抑制HaCat细胞中转录因子Stat3/p-Stat3的表达及促炎因子IL-23,趋化因子CCL20的分泌。研究方法:1.将 hucMSCs-Exo 的浓度设置成 0.5μg/ml、1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml几个梯度,分别与DCs和HaCat细胞共培养,根据DCs中CD11c、MHCⅡ、CD86表达变化以及HaCat细胞分泌IL-23、CCL20含量变化,选择最佳共培养浓度。2.从4～6周龄C57BL/6小鼠的骨髓中提取DCs并培养,把DCs分为imDC、mDC+PBS、mDC+hucMSCs-Exo 三组,将 hucMSCs-Exo 与 DCs 共培养 24 小时。1)收集细胞,采用流式测定DCs特异性表型CD11c、MHCⅡ、CD86,观察各组DCs的CD11c、MHCⅡ、CD86比例变化,探讨hucMSCs-Exo对DCs成熟与活化的影响;2)汇集各实验分组的上清液,采用酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测 IL-23 的表达,观察 DCs 在 hucMSCs-Exo 影响下,分泌的细胞因子的变化情况。3.用IL-17A刺激HaCat细胞营造银屑病样炎症环境,把细胞分为IL-17A+PBS组和 IL-17A+hucMSCs-Exo,将 hucMSCs-Exo 与 HaCat 细胞共培养 24 小时。1)汇集各分组的细胞,利用Western Blotting测定转录因子Stat3/p-Stat3的变化情况;2)收集各组细胞上清液,采用ELISA法检测促炎因子IL-23、趋化因子CCL20的表达,观察hucMSCs-Exo对HaCat细胞分泌细胞因子及趋化因子的影响。研究结果:1.经设置不同的浓度梯度观察,发现hucMSCs-Exo浓度为2.5μg/ml时是与DCs及HaCat细胞共培养的最佳浓度。2.DCs:与加入同等剂量的PBS组相比,加入hucMSCs-Exo组的DCs中的CD11c+MHCⅡ+、CD11c+CD86+及 CD11c+MHCⅡ+CD86+表达明显下降,并且细胞上清液中IL-23的含量也随之下降。3.HaCat细胞:与加入同等剂量的PBS组相比,hucMSCs-Exo可以明显抑制HaCat细胞中Stat3/p-Stat3的表达,并且上清液中CCL20、IL-23的比例亦下降。结论:1.HucMSCs-Exo可以抑制DCs的成熟、活化及其促炎因子IL-23的分泌。2.HucMSCs-Exo可以抑制HaCat细胞中转录因子Stat3/p-Stat3的表达及其促炎因子IL-23、趋化因子CCL20的分泌。第三部分:HucMSCs-Exo减轻银屑病样小鼠皮肤炎症的作用机制研究研究目的:1.探索皮下注射到银屑病样小鼠皮肤中的hucMSCs-Exo最佳剂量。2.使用小鼠制备银屑病样动物模型,察看hucMSCs-Exo是否减轻银屑病样动物模型的炎症反应。3.探讨hucMSCs-Exo抑制银屑病样小鼠皮肤炎症的作用机制。研究方法:1.探索皮下注射hucMSCs-Exo的剂量:我们设置了 10 μg/只、30 μg/只、50 μg/只、100 μg/只、400 μg/只的剂量梯度,在小鼠造模的第0、2、4天将hucMSCs-Exo分多点皮下注射到小鼠背部皮肤,观察小鼠背部皮肤变化情况,小鼠背部皮肤在不同剂量下其红斑、鳞屑、皮肤厚度三方面的变化情况,选择最终皮下注射hucMSCs-Exo的剂量。2.造模:将C57BL/6小鼠（8W）后背的毛剃除干净,每天用5%的咪喹莫特（imiquimod,IMQ）乳膏（62.5mg/每只）外用,连续外用6天;把二十四只C57BL/6小鼠任意划分为四个组,对照组（外涂凡士林软膏）、IMQ组（外涂咪喹莫特乳膏）、IMQ+PBS组、IMQ+hucMSCs-Exo组,在小鼠造模的第0、2、4天,将hucMSCs-Exo（50μg/每只）分多点皮下注射到小鼠背部皮肤,PBS组注射PBS溶液（50 μl/每只）,观察各组小鼠背部皮肤变化情况。3.将不同分组中的小鼠皮肤剪下收集保存,一部分行皮肤病理切片,观察不同组别中小鼠皮肤的病理变化;另一部分采用Western Blotting检测各组小鼠背部皮肤中转录因子Stat3/p-Stat3,炎症因子IL-17、促炎因子IL-23及趋化因子CCL20的变化。研究结果:1.通过察看小鼠背部皮损薄厚程度、颜色变化、鳞屑缓解情况,我们发现皮下注射hucMSCs-Exo 50 μg/只,小鼠皮肤症状缓解的比较明显,100μg/只、400 μg/只的小鼠红斑、鳞屑及皮肤厚度较50 μg/只没有得到更明显的缓解,因此我们后续实验皮下注射hucMSCs-Exo的剂量我们选择50 μg/只。2.造模:1)小鼠背上的皮损逐渐增厚并显现出红色斑片、白色鳞屑;2)小鼠皮肤病理切片可见表皮厚度增加及角化不全,颗粒层减少,棘层变宽,表皮突向下延长;3)Western Blotting检测银屑病样小鼠皮肤中的Stat3/p-Stat3、IL-17、IL-23、CCL20显著表达。3.小鼠背部皮肤症状变化:1)较皮下注射PBS组,皮下注射hucMSCs-Exo可以明显缓解小鼠背部皮肤的红斑、鳞屑及皮肤厚度,PASI评分显著下降;2)小鼠皮肤组织病理显示,较皮下注射PBS组,皮下注射hucMSCs-Exo可以明显减轻表皮增厚的程度。4.小鼠背部皮肤相关因子检测:较皮下注射PBS组,皮下注射hucMSCs-Exo可以明显抑制转录因子Stat3/p-Stat3,炎症因子IL-17A、促炎因子IL-23及趋化因子CCL20的表达。结论:1.HucMSCs-Exo可能通过抑制信号通路STAT3/p-STAT3,从而抑制IL-23/Th17轴过度激活,减少炎性因子IL-17、促炎因子IL-23及趋化因子CCL20的释放。2.HucMSCs-Exo能够显著缓解银屑病样小鼠的炎性反应。