论文部分内容阅读
本论文以复方中草药调控肥育猪肉品质和肌纤维类型变化为表型，使用mRNA-miRNAs联合高通量测序技术，筛选出调控肌纤维类型转化相关的基因和miRNAs，并进行相关功能分析和研究，探讨其对肌纤维类型的调控机制。本研究分为以下五个部分：
第一部分：复方中草药的组成、组分分析及其对大鼠生长性能、内脏器官重量和指数的影响
本试验所用复方中草药包括25%黄芪、20%甘草、15%杜仲叶、10%白术、10%干姜、10%山楂和10%其他组分（金樱子、女贞子和陈皮）。结果表明：（1）复方中草药的主要活性成分包括芒柄花素、甘草甙、杜仲醇、6-姜酚、熊果酸、苍术內酯、甘草酸、绿原酸、红景天苷、川陈皮素和特女贞苷。（2）复方中草药生理盐水处理液灌服大鼠后，未出现大鼠死亡，对大鼠体重、日采食量、日增重和耗料增重比无显著影响（P>0.05），大鼠内脏器官重量及其指数与对照组相比，没有明显变化（P>0.05）。
第二部分：复方中草药对肥育猪生长性能、胴体品质、肉品质的影响
选取146日龄的去势（皮×杜，♂）×（长×大，♀）公猪90头（84.04±0.05kg），按体重一致随机分成3个处理组，每个处理组5个重复，每个重复6头猪；试验处理分别为在基础日粮的基础上分别添加0、0.25%、0.5%复方中草药；试验期为35d。结果表明：（1）日粮添加复方中草药对肥育猪生长性能、胴体品质均无显著性影响（P>0.05）；（2）日粮添加0.25%复方中草药显著提高肥育猪背最长肌肉色红度值37.08%（P<0.05）；日粮添加0.25%复方中草药显著提高肥育猪背最长肌肉色评分和大理石纹评分（P<0.05）；日粮中添加0.25%复方中草药和0.5%复方中草药分别显著降低肥育猪背最长肌丙二醛含量24.49%和48.57%（P<0.05）；（3）日粮中添加复方中草药显著提高肥育猪背最长肌肌内脂肪含量（P<0.05），其中日粮添加0.25%复方中草药比对照组增加57.41%（P<0.05），日粮添加0.25%复方中草药比对照组增加43.83%（P<0.05）；（4）日粮添加0.25%复方中草药显著降低肥育猪背最长肌十七碳烷酸（C17:0）和亚油酸（C18:2n-6）比例（P<0.05）；日粮添加0.5%复方中草药显著提高背最长肌油酸（C18:1）比例（P<0.05）；日粮中添加0.25%复方中草药肥育猪背最长肌二十碳烯酸（C20:1）比例显著高于其他两组（P<0.05）；日粮添加0.25%复方中草药显著增加肥育猪背最长肌天冬氨酸含量（P<0.05）；日粮添加0.5%复方中草药显著降低肥育猪背最长肌次黄嘌呤含量33.89%（P<0.05），显著增加肥育猪背最长肌脯氨酸和甜味氨基酸含量（P<0.05）。
第三部分：复方中草药对肥育猪肌纤维类型的影响及其与肉品质的关系
本试验通过研究日粮中添加复方中草药对肥育猪肌纤维类型的影响，以及与肉品质之间的关系，探讨复方中草药是否通过改变肌纤维类型对猪肉品质产生影响。试验结果表明：（1）日粮添加0.25%复方中草药显著增加肥育猪背最长肌Ⅰ型肌纤维面积比例2.35%（P<0.05）；日粮添加0.5%复方中草药肥育猪背最长肌Ⅱb+Ⅱx型肌纤维面积比例显著高于日粮添加0.25%复方中草药（P<0.05）。（2）日粮添加复方中草药显著增加肥育猪背最长肌MyHCⅠmRNA表达丰度（P<0.05）。（3）肉色亮度值L*分别与Ⅰ型、Ⅱa型肌纤维面积比例、Ⅰ/Ⅱ成显著负相关（r=-0.52,-0.58和-0.53, P<0.05），与Ⅱb+Ⅱx型肌纤维面积比例成显著正相关（r=0.63, P<0.05）；肉色红度值 a*分别与Ⅰ型肌纤维面积比例、Ⅰ/Ⅱ成显著正相关（ r=0.57和0.58, P<0.05）；肌苷酸含量与Ⅱa型肌纤维面积比例成显著正相关（r=0.64, P<0.05）；MyHCⅠ分别与猪背最长肌肌内脂肪和甜味氨基酸含量成极显著正相关（ r=0.71和0.79, P<0.01），与次黄嘌呤含量成显著负相关（r=-0.52, P<0.05）；肌纤维Ⅱb+Ⅱx横截面积与pH45min成显著正相关（r=0.59, P<0.05）。（4）酶组化染色分型和RT-qPCR方法确定肌纤维类型规律较一致，酶组化染色分型方法更为直观。
第四部分：mRNA和miRNA表达谱分析与肌纤维类型的关键因子筛选
表达谱分析结果表明：（1）对照组和日粮添加0.25%复方中药处理的肥育猪背最长肌共同表达的基因为29647个，差异表达的基因都为75个。（2）GO分析将对照组和日粮添加0.25%复方中药处理的肥育猪背最长肌差异表达的基因，富集到肌肉生成、肌肉收缩、能量代谢等通路，KEGG分析富集到与骨骼肌能量代谢和转移过程相关的糖酵解和糖原生成、Wnt-蛋白结合通路、PPAR信号通路、丙酮酸代谢和TCA循环，这些通路直接或间接与肌肉收缩和肌纤维类型相关。（3）DGE表达谱分析筛选出可能参与复方中草药调控肌纤维类型转化的相关基因，包括 MYH7、PPARδ、MAPK6、MEF2C、MSTN、FoxO1、MyoD1和CaMK等。（4）miRNAs表达谱共获得1842条成熟体miRNAs和1663条pre-miRNAs，新发现的成熟体miRNAs有1128条，新发现的pre-miRNAs有41条。在获得的1842条成熟体miRNAs中，对照组和日粮添加0.25%复方中药处理的肥育猪背最长肌共表达的miRNA有706条，特异表达的miRNA分别为48和116条。（5）KEGG分析将对照组和日粮添加0.25%复方中药处理的肥育猪背最长肌差异表达的miRNAs，富集到mTOR信号通路、MAPK信号通路、磷酸肌醇代谢、TCA循环等与肌纤维类型相关的通路。（6）miRNAs表达谱分析筛选出可能参与复方中草药调控肌纤维类型转化的相关 miRNAs，包括ssc-miR-423-5p和 ssc-miR-27a等。（7）直接或间接靶向慢型肌纤维基因 MYH7的miRNAs共有24个；ssc-miR-423-5p、ssc-miR-320和ssc-miR-27a等的靶位点结合能值较低。
第五部分：miR-27a调控慢型肌纤维途径的确定
本试验旨在通过 miR-27a为例（选择 miR-27a的原因见本论文第6章），阐明miRNA调控肌纤维类型的原理。试验结果表明：（1）通过猪骨骼肌卫星细胞分化前后变化比较确定miR-27a与PGC-1α和MYH7具有相反的表达趋势。（2）通过肌细胞转染miR-27a mimics/inhibitor确定miR-27a具有调控慢型肌纤维基因和标志性蛋白的作用。（3）通过PGC-1α、MEF2C以及相关线粒体基因和酶活表达（NRF-1、mtTFA、COXⅣ、Cytc和SDH），进一步明确miR-27a可能是通过PGC-1α-MEF2C通路调控慢型肌纤维。（4）通过siRNA干扰肌细胞内源性PGC-1α试验，确定miR-27a是直接靶向 PGC-1α，并且可能是通过 PGC-1α-MEF2C途径调控慢型肌纤维。（5）双荧光素酶报告基因的试验提示，miR-27a能结合预测的PGC-1α的靶位点序列，表明miR-27a与PGC-1α存在靶位关系，miR-27a抑制PGC-1α的表达。
综上所述，本研究以复方中草药改善肥育猪肉色等表观性状和调控肌纤维类型及其两者的关系为切入点，深入挖掘出参与调控肌纤维类型的基因、miRNAs和信号通路，并明确miR-27a可能是通过PGC-1α-MEF2C-MYH7通路调控肌纤维类型转化。
第一部分：复方中草药的组成、组分分析及其对大鼠生长性能、内脏器官重量和指数的影响
本试验所用复方中草药包括25%黄芪、20%甘草、15%杜仲叶、10%白术、10%干姜、10%山楂和10%其他组分（金樱子、女贞子和陈皮）。结果表明：（1）复方中草药的主要活性成分包括芒柄花素、甘草甙、杜仲醇、6-姜酚、熊果酸、苍术內酯、甘草酸、绿原酸、红景天苷、川陈皮素和特女贞苷。（2）复方中草药生理盐水处理液灌服大鼠后，未出现大鼠死亡，对大鼠体重、日采食量、日增重和耗料增重比无显著影响（P>0.05），大鼠内脏器官重量及其指数与对照组相比，没有明显变化（P>0.05）。
第二部分：复方中草药对肥育猪生长性能、胴体品质、肉品质的影响
选取146日龄的去势（皮×杜，♂）×（长×大，♀）公猪90头（84.04±0.05kg），按体重一致随机分成3个处理组，每个处理组5个重复，每个重复6头猪；试验处理分别为在基础日粮的基础上分别添加0、0.25%、0.5%复方中草药；试验期为35d。结果表明：（1）日粮添加复方中草药对肥育猪生长性能、胴体品质均无显著性影响（P>0.05）；（2）日粮添加0.25%复方中草药显著提高肥育猪背最长肌肉色红度值37.08%（P<0.05）；日粮添加0.25%复方中草药显著提高肥育猪背最长肌肉色评分和大理石纹评分（P<0.05）；日粮中添加0.25%复方中草药和0.5%复方中草药分别显著降低肥育猪背最长肌丙二醛含量24.49%和48.57%（P<0.05）；（3）日粮中添加复方中草药显著提高肥育猪背最长肌肌内脂肪含量（P<0.05），其中日粮添加0.25%复方中草药比对照组增加57.41%（P<0.05），日粮添加0.25%复方中草药比对照组增加43.83%（P<0.05）；（4）日粮添加0.25%复方中草药显著降低肥育猪背最长肌十七碳烷酸（C17:0）和亚油酸（C18:2n-6）比例（P<0.05）；日粮添加0.5%复方中草药显著提高背最长肌油酸（C18:1）比例（P<0.05）；日粮中添加0.25%复方中草药肥育猪背最长肌二十碳烯酸（C20:1）比例显著高于其他两组（P<0.05）；日粮添加0.25%复方中草药显著增加肥育猪背最长肌天冬氨酸含量（P<0.05）；日粮添加0.5%复方中草药显著降低肥育猪背最长肌次黄嘌呤含量33.89%（P<0.05），显著增加肥育猪背最长肌脯氨酸和甜味氨基酸含量（P<0.05）。
第三部分：复方中草药对肥育猪肌纤维类型的影响及其与肉品质的关系
本试验通过研究日粮中添加复方中草药对肥育猪肌纤维类型的影响，以及与肉品质之间的关系，探讨复方中草药是否通过改变肌纤维类型对猪肉品质产生影响。试验结果表明：（1）日粮添加0.25%复方中草药显著增加肥育猪背最长肌Ⅰ型肌纤维面积比例2.35%（P<0.05）；日粮添加0.5%复方中草药肥育猪背最长肌Ⅱb+Ⅱx型肌纤维面积比例显著高于日粮添加0.25%复方中草药（P<0.05）。（2）日粮添加复方中草药显著增加肥育猪背最长肌MyHCⅠmRNA表达丰度（P<0.05）。（3）肉色亮度值L*分别与Ⅰ型、Ⅱa型肌纤维面积比例、Ⅰ/Ⅱ成显著负相关（r=-0.52,-0.58和-0.53, P<0.05），与Ⅱb+Ⅱx型肌纤维面积比例成显著正相关（r=0.63, P<0.05）；肉色红度值 a*分别与Ⅰ型肌纤维面积比例、Ⅰ/Ⅱ成显著正相关（ r=0.57和0.58, P<0.05）；肌苷酸含量与Ⅱa型肌纤维面积比例成显著正相关（r=0.64, P<0.05）；MyHCⅠ分别与猪背最长肌肌内脂肪和甜味氨基酸含量成极显著正相关（ r=0.71和0.79, P<0.01），与次黄嘌呤含量成显著负相关（r=-0.52, P<0.05）；肌纤维Ⅱb+Ⅱx横截面积与pH45min成显著正相关（r=0.59, P<0.05）。（4）酶组化染色分型和RT-qPCR方法确定肌纤维类型规律较一致，酶组化染色分型方法更为直观。
第四部分：mRNA和miRNA表达谱分析与肌纤维类型的关键因子筛选
表达谱分析结果表明：（1）对照组和日粮添加0.25%复方中药处理的肥育猪背最长肌共同表达的基因为29647个，差异表达的基因都为75个。（2）GO分析将对照组和日粮添加0.25%复方中药处理的肥育猪背最长肌差异表达的基因，富集到肌肉生成、肌肉收缩、能量代谢等通路，KEGG分析富集到与骨骼肌能量代谢和转移过程相关的糖酵解和糖原生成、Wnt-蛋白结合通路、PPAR信号通路、丙酮酸代谢和TCA循环，这些通路直接或间接与肌肉收缩和肌纤维类型相关。（3）DGE表达谱分析筛选出可能参与复方中草药调控肌纤维类型转化的相关基因，包括 MYH7、PPARδ、MAPK6、MEF2C、MSTN、FoxO1、MyoD1和CaMK等。（4）miRNAs表达谱共获得1842条成熟体miRNAs和1663条pre-miRNAs，新发现的成熟体miRNAs有1128条，新发现的pre-miRNAs有41条。在获得的1842条成熟体miRNAs中，对照组和日粮添加0.25%复方中药处理的肥育猪背最长肌共表达的miRNA有706条，特异表达的miRNA分别为48和116条。（5）KEGG分析将对照组和日粮添加0.25%复方中药处理的肥育猪背最长肌差异表达的miRNAs，富集到mTOR信号通路、MAPK信号通路、磷酸肌醇代谢、TCA循环等与肌纤维类型相关的通路。（6）miRNAs表达谱分析筛选出可能参与复方中草药调控肌纤维类型转化的相关 miRNAs，包括ssc-miR-423-5p和 ssc-miR-27a等。（7）直接或间接靶向慢型肌纤维基因 MYH7的miRNAs共有24个；ssc-miR-423-5p、ssc-miR-320和ssc-miR-27a等的靶位点结合能值较低。
第五部分：miR-27a调控慢型肌纤维途径的确定
本试验旨在通过 miR-27a为例（选择 miR-27a的原因见本论文第6章），阐明miRNA调控肌纤维类型的原理。试验结果表明：（1）通过猪骨骼肌卫星细胞分化前后变化比较确定miR-27a与PGC-1α和MYH7具有相反的表达趋势。（2）通过肌细胞转染miR-27a mimics/inhibitor确定miR-27a具有调控慢型肌纤维基因和标志性蛋白的作用。（3）通过PGC-1α、MEF2C以及相关线粒体基因和酶活表达（NRF-1、mtTFA、COXⅣ、Cytc和SDH），进一步明确miR-27a可能是通过PGC-1α-MEF2C通路调控慢型肌纤维。（4）通过siRNA干扰肌细胞内源性PGC-1α试验，确定miR-27a是直接靶向 PGC-1α，并且可能是通过 PGC-1α-MEF2C途径调控慢型肌纤维。（5）双荧光素酶报告基因的试验提示，miR-27a能结合预测的PGC-1α的靶位点序列，表明miR-27a与PGC-1α存在靶位关系，miR-27a抑制PGC-1α的表达。
综上所述，本研究以复方中草药改善肥育猪肉色等表观性状和调控肌纤维类型及其两者的关系为切入点，深入挖掘出参与调控肌纤维类型的基因、miRNAs和信号通路，并明确miR-27a可能是通过PGC-1α-MEF2C-MYH7通路调控肌纤维类型转化。