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【摘要】 目的：观察不同材质导尿管对大肠埃希菌生物膜形成的影响。方法：在乳胶、纯硅胶、硅橡胶材质导尿管膜片上制备大肠埃希菌生物膜，扫描电镜观察生物膜的形态。用冲洗、冲洗+超声振荡方法处理附有不同生长时期生物膜的导尿管，通过菌落计数法了解两种方法对不同时期生物膜的清除效应。结果：乳胶、纯硅胶、硅橡胶导尿管生物膜内均有细菌团块样聚集，可见纤维素样物质交联。硅橡胶导尿管生物膜内纤维素样交联物相对较少。在生物膜形成的初期，两种处理方法具有相同清除效应；但当生物膜趋于成熟后，单用冲洗方法难以将黏附细菌洗脱。结论：建议选择使用经济、实用的硅橡胶导尿管。在生物膜形成初期，对导尿管一般冲洗能较彻底地清除黏附细菌。
【关键词】 导尿管； 大肠埃希菌； 生物膜； 扫描电镜
留置导尿是临床常用的一种操作技术，导尿管伴随尿道感染（Catheter-associated urinary tract infection，CAUTI）是留置导尿引起的一种常见的医院感染。尽管采取无菌操作等措施，仍然有1/3导尿管伴随尿路感染无法控制。导尿管的生物材料等因素与泌尿系统感染有直接关系。笔者对比不同材质导尿管生物膜形成的过程，为临床合理选择导尿管提供客观依据。
1 材料与方法
1.1 导尿管种类 纯硅胶导尿管（广州市香雪生物医学工程有限公司）、乳胶导尿管（广州市韦士泰医疗器械有限公司）、硅橡胶导尿管（秦皇岛市旭明医用硅橡胶制品有限公司）。
1.2 标准菌株 大肠埃希菌菌株：沈阳医学院病原生物学教研室提供（经ATB生化鉴定）。
1.3 生物膜的制备 将三种材料的导尿管用打孔器制备成直径为0.7 cm圆片，高压蒸汽灭菌后分别放入含有2 mL/孔MH肉汤的12孔培养板，每孔加入0.5比浊的大肠埃希菌菌液50 ?L，置于37 ℃生化培养箱中培养，每24小时更换培养液一次，共培养3 d。
1.4 扫描电镜观察 取出培养18、24、48、72 h导尿管膜片，用无菌生理盐水冲洗，洗掉浮游细菌，至2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定2 h，以pH 7.2的磷酸缓冲液冲洗3次，20 min/次，再以1%锇酸4 ℃固定2 h，4 ℃磷酸缓冲液冲洗3次，20 min/次，梯度乙醇脱水，醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，离子喷金镀膜，通过SEM进行观察。
1.5 处理生物膜 分别在孵育18、24、48、72 h各取出6块膜片，分成两组，每组3片，分别用以下两种方法处理：（1）用0.9%NS 2mL冲洗5次，收集洗脱液于20 mL无菌离心管里。（2）用0.9%NS 2 mL冲洗4次，置于含2 mL 0.9%NS的无菌试管中，超声震荡120 W，15 min，收集所有洗脱液（6 mL）于20 mL无菌离心管里。将以上两种方法所得洗脱液吸取0.1 mL，倍比稀释至10万倍，取出0.1 mL稀释液注入无菌平皿中，加入高压蒸汽灭菌后冷却至40 ℃左右的营养琼脂中混匀，置于37 ℃生化培养箱，孵育24 h，用全自动菌落分析仪（杭州迅数科技有限公司，型号HR2）计数细菌培养基上菌落数量。上述实验重复进行三次。
1.6 菌落计数的换算 按以下公式算出实际菌落数。实际菌落数（CFU/cm3）=肉眼可计菌落数×稀释倍数/膜片体积，取实际菌落数的常用对数（lgCFU/cm3）为标准菌落计数单位。
1.7 统计学处理 菌落计数换算为标准菌落计数单位，采用SAS 8.1软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验或方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 扫描电镜观察 大肠埃希菌在纯硅胶、乳胶、硅橡胶三种材质表面孵育早期（18～24 h），无明显细菌生物膜形成。培养48 h后，细菌生物膜形成。硅橡胶导尿管表面细菌生物膜形成较晚且生物膜内细菌数量相对较少，见图1。
2.2 菌落计数比较 大肠埃希菌在纯硅胶、乳胶、硅橡胶三种材质表面孵育早期（18～24 h），冲洗和冲洗+振荡两种处理方法的生物膜内细菌的菌落计数比较差异无统计学意义（P>0.05），且经过冲洗+振荡处理后三种材质间的对数菌落计算的比较差异也均无统计学意义（F=0.03，P=0.9584；F=3.56，P=0.0923）。而在生物膜形成的后期48 h和72 h时，冲洗和冲洗+振荡两种处理方法的生物膜内细菌的菌落计数比较差异均有统计学意义（P<0.05），三种材质间的对数菌落计算的比较差异均有统计学意义（F=16.77，P=0.0015；F=89.21，P=0.0001），见表1。
3 讨论
细菌生物膜（bacteria biofilm，BBF）是附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹着细菌的细菌自身所分泌的含水聚合性基质组成的结构性细菌群落。细菌生物膜内的细菌具有传染性和致病性，是医院感染最主要的原因[1-2]。研究认为超过60%的感染是由细菌生物膜引起的[3]。细菌能黏附几乎所有医疗器械的材料表面形成生物膜，其中以中心静脉导管、导尿管更为常见[4-5]。细菌生物膜是导尿管伴随尿路感染的重要物质基础。
导尿管伴随尿路感染可由多种微生物引起，在众多病原体中，大肠埃希菌的检出率为最高[6]。笔者以临床较常使用的三种材质的导尿管为载体，在大肠埃希菌细菌悬液中体外分别孵育18、24、48、72 h，制备细菌生物膜模型，用扫描电镜观察生物膜的形成过程。当细菌未黏附至生物材料前，生物材质本身的化学成分影响细菌的生长繁殖，关系到最终黏附于生物材料上的细菌数量。生物膜内细菌寄生于体内植入物表面形成膜状物，包裹在导尿管表面，生物膜内细菌通过特殊的耐药机制和缓慢释放引起患者泌尿道和全身感染[7]。如表1所示，不同材质导尿管细菌生物膜情况不同。通过扫描电镜观察生物膜形成的动态过程可见，生物膜形成分为两个阶段：首先由细菌表面疏水性蛋白或多糖黏附素对生物材料的初始附着，形成细菌群落；而后细菌主要通过多糖胞间黏附素介导，相互聚集，形成生物膜[8-10]。细菌在孵育第18～24小时增殖较慢，由于细菌被接种到培养基后最初的一段时间，细菌需要适应新环境，为持续不断地增殖做准备。第48～72小时细菌分裂繁殖速度明显增快。三种材料的生物膜内均见细菌团块聚集，菌体周围可见由纤维素样物质交联的现象。但观察可见，硅橡胶导尿管材料中，有的部位仅见大量细菌附着，纤维素样物质交联相对较少。纤维素样交联物是细菌分泌的多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白。细菌大量聚集，其间由纤维素样物质交联，可使抗生素的作用大大地减弱。扫描电镜下图像说明，硅橡胶材料组织相容性较好，对比纯硅胶和乳胶导尿管，形成生物膜能力相对较差。 鉴于生物膜内细菌生长的动态规律，通过不同方法对黏附大肠埃希菌的三种材质导尿管进行处理，比较两种方法的优劣。如表1～2所示，在生物膜形成的初期（24 h），冲洗和冲洗+超声振荡两种方法处理生物膜，均能较彻底地洗脱黏附细菌，这可能与早期生长细菌菌量较少及黏附不牢固有关；随着生物膜的成熟，细菌繁殖增多，且黏附牢固，这时单用冲洗方法难于将生物膜洗脱下来，被洗脱下来的菌落数与经超声振荡所得菌落数相比，已明显减少；从冲洗组的动态看，菌落数随着培养时间的延长有逐渐减少的趋势，与超声振荡的趋势相反。
对临床需要长期留置导尿管患者，除临床常规采取的无菌护理外，使用不同材料导尿管可有效较少导尿管相关尿路感染的发生[11]。建议选择使用经济、实用的硅橡胶导尿管，在留置导尿管早期进行膀胱冲洗，可减少导尿管伴随尿路感染的发生。
参考文献
[1]沈建，冯晨，沈香娣，等.铜绿假单胞菌体外生物膜模型的建立和鉴定[J].医学研究杂志，2013，42（1）：50-54.
[2] Mateo M，Maestre J R，Aguilar L，et al.Strong slime production is a marker of clinical significance in Staphylococcus epidermidis isolated from intravascular catheters[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2008，27（4）：311-314.
[3] Jacobsen S M，Stickler D J，Mobley H L T，et al.Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis[J].Clin Microbiol Rev，2008，21（1）：26-59.
[4]邱凯.细菌生物膜预防与去除的研究进展[J].中国消毒学杂志，2011，28（3）：358-360.
[5] Leone M，Albanèse J，Garnier F，et al.Risk factors of nosocomial catheter-associated urinary tract infection in a polyvalent intensive care unit[J].Intensive Care Med，2003，29（7）：1077-1080.
[6]方芳，毕海波，陈冬梅，等.留置导尿致尿路感染病原菌分布及耐药性分析[J].沈阳医学院学报，2010，12（4）：199-200.
[7]许宏，韦莉萍.留置导尿相关感染的研究进展[J].护士进修杂志，2005，20（1）：7-8.
[8]叶联华，黄云超，李高峰，等.生物材料植入后发生感染与表皮葡萄球菌生物膜[J].生物医学工程与临床，2010，14（1）：79-82.
[9]陈曦伟，崔玉东，张华，等.金黄色葡萄球菌生物膜形成的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2011（6）：34-36.
[10] Qin Z，Zhang J，Hu Y，et al.Organic compounds inhibiting S.epidermidis adhe sion and biofilm formation[J].Ultramicroscopy，2009，109（8）：881-888.
[11]袁望舒，刘忠良，张海娜，等.导尿管相关尿路感染的防治现状及展望[J].中华医院感染学杂志，2011，21（9）：1936-1938.
（收稿日期：2013-12-20） （本文编辑：欧丽）
【关键词】 导尿管； 大肠埃希菌； 生物膜； 扫描电镜
留置导尿是临床常用的一种操作技术，导尿管伴随尿道感染（Catheter-associated urinary tract infection，CAUTI）是留置导尿引起的一种常见的医院感染。尽管采取无菌操作等措施，仍然有1/3导尿管伴随尿路感染无法控制。导尿管的生物材料等因素与泌尿系统感染有直接关系。笔者对比不同材质导尿管生物膜形成的过程，为临床合理选择导尿管提供客观依据。
1 材料与方法
1.1 导尿管种类 纯硅胶导尿管（广州市香雪生物医学工程有限公司）、乳胶导尿管（广州市韦士泰医疗器械有限公司）、硅橡胶导尿管（秦皇岛市旭明医用硅橡胶制品有限公司）。
1.2 标准菌株 大肠埃希菌菌株：沈阳医学院病原生物学教研室提供（经ATB生化鉴定）。
1.3 生物膜的制备 将三种材料的导尿管用打孔器制备成直径为0.7 cm圆片，高压蒸汽灭菌后分别放入含有2 mL/孔MH肉汤的12孔培养板，每孔加入0.5比浊的大肠埃希菌菌液50 ?L，置于37 ℃生化培养箱中培养，每24小时更换培养液一次，共培养3 d。
1.4 扫描电镜观察 取出培养18、24、48、72 h导尿管膜片，用无菌生理盐水冲洗，洗掉浮游细菌，至2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定2 h，以pH 7.2的磷酸缓冲液冲洗3次，20 min/次，再以1%锇酸4 ℃固定2 h，4 ℃磷酸缓冲液冲洗3次，20 min/次，梯度乙醇脱水，醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，离子喷金镀膜，通过SEM进行观察。
1.5 处理生物膜 分别在孵育18、24、48、72 h各取出6块膜片，分成两组，每组3片，分别用以下两种方法处理：（1）用0.9%NS 2mL冲洗5次，收集洗脱液于20 mL无菌离心管里。（2）用0.9%NS 2 mL冲洗4次，置于含2 mL 0.9%NS的无菌试管中，超声震荡120 W，15 min，收集所有洗脱液（6 mL）于20 mL无菌离心管里。将以上两种方法所得洗脱液吸取0.1 mL，倍比稀释至10万倍，取出0.1 mL稀释液注入无菌平皿中，加入高压蒸汽灭菌后冷却至40 ℃左右的营养琼脂中混匀，置于37 ℃生化培养箱，孵育24 h，用全自动菌落分析仪（杭州迅数科技有限公司，型号HR2）计数细菌培养基上菌落数量。上述实验重复进行三次。
1.6 菌落计数的换算 按以下公式算出实际菌落数。实际菌落数（CFU/cm3）=肉眼可计菌落数×稀释倍数/膜片体积，取实际菌落数的常用对数（lgCFU/cm3）为标准菌落计数单位。
1.7 统计学处理 菌落计数换算为标准菌落计数单位，采用SAS 8.1软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验或方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 扫描电镜观察 大肠埃希菌在纯硅胶、乳胶、硅橡胶三种材质表面孵育早期（18～24 h），无明显细菌生物膜形成。培养48 h后，细菌生物膜形成。硅橡胶导尿管表面细菌生物膜形成较晚且生物膜内细菌数量相对较少，见图1。
2.2 菌落计数比较 大肠埃希菌在纯硅胶、乳胶、硅橡胶三种材质表面孵育早期（18～24 h），冲洗和冲洗+振荡两种处理方法的生物膜内细菌的菌落计数比较差异无统计学意义（P>0.05），且经过冲洗+振荡处理后三种材质间的对数菌落计算的比较差异也均无统计学意义（F=0.03，P=0.9584；F=3.56，P=0.0923）。而在生物膜形成的后期48 h和72 h时，冲洗和冲洗+振荡两种处理方法的生物膜内细菌的菌落计数比较差异均有统计学意义（P<0.05），三种材质间的对数菌落计算的比较差异均有统计学意义（F=16.77，P=0.0015；F=89.21，P=0.0001），见表1。
3 讨论
细菌生物膜（bacteria biofilm，BBF）是附着于惰性或者活性实体表面的细菌细胞和包裹着细菌的细菌自身所分泌的含水聚合性基质组成的结构性细菌群落。细菌生物膜内的细菌具有传染性和致病性，是医院感染最主要的原因[1-2]。研究认为超过60%的感染是由细菌生物膜引起的[3]。细菌能黏附几乎所有医疗器械的材料表面形成生物膜，其中以中心静脉导管、导尿管更为常见[4-5]。细菌生物膜是导尿管伴随尿路感染的重要物质基础。
导尿管伴随尿路感染可由多种微生物引起，在众多病原体中，大肠埃希菌的检出率为最高[6]。笔者以临床较常使用的三种材质的导尿管为载体，在大肠埃希菌细菌悬液中体外分别孵育18、24、48、72 h，制备细菌生物膜模型，用扫描电镜观察生物膜的形成过程。当细菌未黏附至生物材料前，生物材质本身的化学成分影响细菌的生长繁殖，关系到最终黏附于生物材料上的细菌数量。生物膜内细菌寄生于体内植入物表面形成膜状物，包裹在导尿管表面，生物膜内细菌通过特殊的耐药机制和缓慢释放引起患者泌尿道和全身感染[7]。如表1所示，不同材质导尿管细菌生物膜情况不同。通过扫描电镜观察生物膜形成的动态过程可见，生物膜形成分为两个阶段：首先由细菌表面疏水性蛋白或多糖黏附素对生物材料的初始附着，形成细菌群落；而后细菌主要通过多糖胞间黏附素介导，相互聚集，形成生物膜[8-10]。细菌在孵育第18～24小时增殖较慢，由于细菌被接种到培养基后最初的一段时间，细菌需要适应新环境，为持续不断地增殖做准备。第48～72小时细菌分裂繁殖速度明显增快。三种材料的生物膜内均见细菌团块聚集，菌体周围可见由纤维素样物质交联的现象。但观察可见，硅橡胶导尿管材料中，有的部位仅见大量细菌附着，纤维素样物质交联相对较少。纤维素样交联物是细菌分泌的多糖基质、纤维蛋白、脂蛋白。细菌大量聚集，其间由纤维素样物质交联，可使抗生素的作用大大地减弱。扫描电镜下图像说明，硅橡胶材料组织相容性较好，对比纯硅胶和乳胶导尿管，形成生物膜能力相对较差。 鉴于生物膜内细菌生长的动态规律，通过不同方法对黏附大肠埃希菌的三种材质导尿管进行处理，比较两种方法的优劣。如表1～2所示，在生物膜形成的初期（24 h），冲洗和冲洗+超声振荡两种方法处理生物膜，均能较彻底地洗脱黏附细菌，这可能与早期生长细菌菌量较少及黏附不牢固有关；随着生物膜的成熟，细菌繁殖增多，且黏附牢固，这时单用冲洗方法难于将生物膜洗脱下来，被洗脱下来的菌落数与经超声振荡所得菌落数相比，已明显减少；从冲洗组的动态看，菌落数随着培养时间的延长有逐渐减少的趋势，与超声振荡的趋势相反。
对临床需要长期留置导尿管患者，除临床常规采取的无菌护理外，使用不同材料导尿管可有效较少导尿管相关尿路感染的发生[11]。建议选择使用经济、实用的硅橡胶导尿管，在留置导尿管早期进行膀胱冲洗，可减少导尿管伴随尿路感染的发生。
参考文献
[1]沈建，冯晨，沈香娣，等.铜绿假单胞菌体外生物膜模型的建立和鉴定[J].医学研究杂志，2013，42（1）：50-54.
[2] Mateo M，Maestre J R，Aguilar L，et al.Strong slime production is a marker of clinical significance in Staphylococcus epidermidis isolated from intravascular catheters[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2008，27（4）：311-314.
[3] Jacobsen S M，Stickler D J，Mobley H L T，et al.Complicated catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis[J].Clin Microbiol Rev，2008，21（1）：26-59.
[4]邱凯.细菌生物膜预防与去除的研究进展[J].中国消毒学杂志，2011，28（3）：358-360.
[5] Leone M，Albanèse J，Garnier F，et al.Risk factors of nosocomial catheter-associated urinary tract infection in a polyvalent intensive care unit[J].Intensive Care Med，2003，29（7）：1077-1080.
[6]方芳，毕海波，陈冬梅，等.留置导尿致尿路感染病原菌分布及耐药性分析[J].沈阳医学院学报，2010，12（4）：199-200.
[7]许宏，韦莉萍.留置导尿相关感染的研究进展[J].护士进修杂志，2005，20（1）：7-8.
[8]叶联华，黄云超，李高峰，等.生物材料植入后发生感染与表皮葡萄球菌生物膜[J].生物医学工程与临床，2010，14（1）：79-82.
[9]陈曦伟，崔玉东，张华，等.金黄色葡萄球菌生物膜形成的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2011（6）：34-36.
[10] Qin Z，Zhang J，Hu Y，et al.Organic compounds inhibiting S.epidermidis adhe sion and biofilm formation[J].Ultramicroscopy，2009，109（8）：881-888.
[11]袁望舒，刘忠良，张海娜，等.导尿管相关尿路感染的防治现状及展望[J].中华医院感染学杂志，2011，21（9）：1936-1938.
（收稿日期：2013-12-20） （本文编辑：欧丽）