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【摘要】 目的：应用碱性裂解液法提取的DNA鉴定环氧化酶（COX）亚型基因敲除小鼠，为鉴定纯合子小鼠提供一种方便快捷、低成本、可靠的实验方法。方法：取子代小鼠耳缘组织于EP管中，用碱性裂解液提取基因组DNA，PCR扩增COX-1和COX-2基因片段，通过琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型作出鉴定。结果：碱性裂解液法提取的DNA能应用于子代小鼠的不同基因型的鉴定，即野生型（COX-1+/+；COX-2+/+）、杂合子（COX-1+/-；COX-2+/-）和纯合子（COX-1-/-；COX-2-/-）。结论：建立了碱性裂解液提取DNA法，并将该法成功应用于环氧化酶亚型基因敲除小鼠基因型鉴定中。
【关键词】 碱性裂解液； 环氧化酶； 基因敲除小鼠
环氧化酶（COX）催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）产生前列腺素类物质，其中在心血管系统主要是前列环素（PGI2）和血栓烷A2（TxA2），COX作为AA代谢中主要的关键限速酶之一，在心血管方面发挥重要的病理生理作用[1]。COX主要包括COX-1和COX-2两种亚型，由于现阶段COX亚型选择性抑制剂存在着非特异性作用，因此基因敲除小鼠对进一步明确COX亚型的生理及病理生理功能具有重要作用，进而建立COX亚型基因敲除小鼠的鉴定方法也就尤为重要[2]。目前，国内基因敲除小鼠鉴定中DNA的提取主要有两种方法，第一种即采用蛋白酶K消化后用经典酚氯仿提取法：通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质，再加入乙醇即可使DNA分离出来；第二种即基因组DNA试剂盒提取法：通过裂解细胞释放出基因组DNA，然后加入核糖核酸酶A去除RNA，接着选择性沉淀去除蛋白，最后通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液[3-4]。碱性裂解液提取DNA法鲜见报道。因此，本实验将建立一种用碱性裂解液提取DNA的方法，为COX亚型基因敲除小鼠鉴定提供更为方便、经济、快速的方法[5]。
1 资料与方法
1.1 一般资料 实验动物：COX亚型基因敲除小鼠引进于北京大学医学部生理系，基因背景为COX-1+/-的杂合子小鼠2雌1雄，基因背景为COX-2+/-的杂合子小鼠2雌1雄，共6只。试剂：PCR试剂盒、DNA marker购自大连宝生物工程有限公司；PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成；重要溶液地配制：溶液A，即NaOH溶液，成分为25 mmol/L NaOH、2 mmol/L EDTA，溶液B的成分为40 mmol/L Tris·HCl，pH值为8.0。仪器：干式恒温器（奥盛仪器有限公司，中国），PCR扩增仪（ABI公司，美国），电泳仪（北京六一仪器厂，中国）。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取 COX基因敲除小鼠按照SPF级动物饲养标准进行饲养。温度控制在22 ℃，光照周期为12 h黑暗，12 h光照；笼具、垫料、饲料和饮水均经过高温高压灭菌处理后使用；自由取食和饮水，垫料一周更换两次。采用1雄和2雌合笼方式进行繁殖。在子代小鼠断乳打耳号进行标记时，留取小鼠耳缘组织于1.5 mL EP管中，加入100 μL溶液A，于干式恒温器100 ℃孵育30 min。再加入100 μL溶液B，充分震荡混匀、离心，放入4 ℃冰箱备用。
1.2.2 基因组DNA扩增 （1）COX-1引物序列：WT-S：
5’-AGGAGATGGCTGCTGAGTTGG-3’，KO-S：5-’GCAGCCTCTGTTCCACATACAC-3’，WT/KO-AS：5’-AATCTGACTTTCTGAGTTGCC-3’。目的基因片段长度为601 bp。各种基因型小鼠扩增片段为：COX-1-/-：646 bp；COX-1+/-：601 bp和646 bp；COX-1+/+：601 bp。COX-2引物序列：WT-S：5’-ACACACTCTATCACTGGCACC-3’，KO-S：5’-ACGCGTCACCTTAATATGCG-3’，WT/KO-AS：5’-ATCCCTTCACTAAATGCCCTC-3’。目的基因片段长度为905 bp。各种基因型小鼠扩增片段为：COX-2-/-：905 bp；COX-2+/-：760 bp和905 bp；COX-2+/+：760 bp。（2）PCR体系：2× Go Taq Green Master Mix 12.5 μL，引物WT-S（10 μmol/L）2.5 μL，引物KO-S（10 μmol/L）2.5 μL，引物WT/KO-AS（10 μmol/L）2.5 μL， 耳缘DNA模板样品1.5 μL，ddH2O补足25 μL。（3）COX-1反应条件：①预变性94 ℃，5 min；②变性94 ℃，30 s；③退火56 ℃，30 s；④延伸72 ℃，30 s，重复步骤②～④40次循环；⑤最后延伸72 ℃，7 min；⑥4 ℃保存。（4）COX-2反应条件：①预变性94 ℃，5 min；②变性94 ℃，45 s；③退火56 ℃，45 s；④延伸72 ℃，45 s，重复步骤②～④35次循环；
⑤最后延伸72 ℃，7 min；⑥4 ℃保存。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 用TBE缓冲液配制1.2%琼脂糖凝胶，待60 ℃左右加入溴化乙啶 （EB） 2 μL （10 mg/mL），混匀后，倒入凝胶板铺板，室温放置30 min，待凝胶完全凝固后放入电泳槽，加入PCR产物10 μL于点样孔，调节电泳电压为100 V，电泳40 min后，观察结果。
2 结果
COX-1子代基因鉴定部分结果如图1所示，凝胶最左侧为Marker，编号2、5、6可见大小为646 bp左右的条带，为纯合子；编号1、3、4、7可见大小为646 bp和601 bp左右的条带，为杂合子；编号8可见大小为601 bp左右的条带，为野生型。 COX-2子代基因鉴定部分结果如图2所示，凝胶最左侧为Maker，编号3可见大小为905 bp左右的条带，为纯合子；编号1、2、4可见大小为905 bp和760 bp左右的条带，为杂合子；编号5可见大小为760 bp左右的条带，为野生型。
3 讨论
小鼠基因敲除技术是研究整体动物水平基因功能的一种直接有效方法，通过基因敲除动物，可以直接分析被敲除基因的功能和作用[6]。目前，心血管系统中COX亚型的生理功能及其在病理状态下的变化尚需进一步明确。一般认为，COX-1为结构型，主要表达于正常组织，在维持肾脏血流和调节血小板聚集中具有重要作用[7]。COX-2为诱导型，又称“炎症反应基因”，正常生理状态下几乎不表达或少表达，当受到刺激后便迅速表达合成，参与多种病理生理过程[8]。深入研究COX在心血管系统的作用机制，有助于明确各种心血管疾病的发生发展机制[9]。
为了进一步确定COX-1和COX-2基因在心血管病理生理方面的功能和作用，本实验室引进了COX-1和COX-2基因敲除小鼠杂合子，严格按照SPF级标准进行小鼠的饲养和繁殖，由于杂合子交配所产生的子代可能出现3种基因型，即野生型（COX-1+/+；COX-2+/+）、杂合子（COX-1+/-；COX-2+/-）和纯合子（COX-1-/-；COX-2-/-），故必须对其子代进行基因鉴定，从而分辨出纯合子用于实验研究。经典酚氯仿提取法虽然用的都是实验室常用试剂，但是较碱性裂解液提取法费时费力，而且苯酚和氯仿还有一定毒性作用；试剂盒提取法提纯效率和纯度都比较高，但相比碱性裂解液提取法而言费用较高，且过程较之复杂。因此，本实验所采用的碱性裂解液提取法相比于经典酚氯仿提取法、试剂盒提取法具有处理过程简单、快捷、省时且经济等优点。通过对不同亚型的COX基因的鉴定，验证了该方法的可靠性。同时，在实验过程中笔者亦观察到：COX-1-/-雌鼠能怀孕但不能够分娩，而COX-2-/-雌鼠不能够受孕，与之前报道的结果一致[10]。故在COX基因亚型敲除小鼠繁殖过程中应采用杂合子雌鼠作为母鼠，才能得到纯合子的子鼠用于实验。
综上所述，碱性裂解液提取DNA法能很好地应用在不同基因型的COX基因亚型敲除小鼠的鉴定中，为基因敲除小鼠鉴定提供了一种便捷、可靠的方法。通过一段时间的繁育及鉴定，得到较多纯合子小鼠，为本实验室进行COX亚型对心血管疾病发生发展机制的研究提供了必要的条件。
参考文献
[1] Félétou M， Huang Y， Vanhoutte P M. Endothelium-mediated control of vascular tone： COX-1 and COX-2 products[J]. Br J Pharmacol， 2011， 164（3）：894-912.
[2]张子房，唐炜，尹江涛.环氧化酶-2、p53和Bcl-2在胃癌组织中的表达及其意义[J].中国医学创新，2009，6（17）：12-15.
[3]董子龙，庄然，张宇丝，等.PTA-1-/-/ApoE-/-双基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定[J].实验动物科学，2012，29（5）：6-8.
[4]杜智勇，粟永萍，杨天德，等.类固醇受体辅活化子-1基因敲除小鼠的繁殖与筛选[J].重庆医学，2007，36（4）：326-327.
[5] Zhang Y H，Huang B L，Eastman K，et al.Mouth cell collection device for newborn mice[J]. Mol Genet Metab，2006，89（12）：164-167.
[6]赵国阳，李光飞，徐又佳.基因敲除技术在骨质疏松相关基因研究中的应用[J].中国骨质疏松杂志，2011，17（8）：748-752.
[7]王燕杰.环氧合酶及其抑制剂与宫颈癌的关系[J].中国临床医学，2012，19（6）：703-704.
[8]张一弛，牟艳玲，解砚英.COX-2与糖尿病并发症关系[J].研究进展生命科学，2012，24（1）：63-68.
[9]蒋跃绒，殷惠军，陈可冀.环氧合酶与心血管疾病[J].心血管病学进展，2006，27（5）：627-630.
[10] St-Louis I， Singh M， Brasseur K，et al.Expression of COX-1 and COX-2 in the endometrium of cyclic，pregnant and in a model of pseudopregnant rats and their regulation by sex steroids[J]. Reprod Biol Endocrinol，2010，24（8）：103.
（收稿日期：2013-11-13） （本文编辑：黄新珍）
【关键词】 碱性裂解液； 环氧化酶； 基因敲除小鼠
环氧化酶（COX）催化花生四烯酸（arachidonic acid，AA）产生前列腺素类物质，其中在心血管系统主要是前列环素（PGI2）和血栓烷A2（TxA2），COX作为AA代谢中主要的关键限速酶之一，在心血管方面发挥重要的病理生理作用[1]。COX主要包括COX-1和COX-2两种亚型，由于现阶段COX亚型选择性抑制剂存在着非特异性作用，因此基因敲除小鼠对进一步明确COX亚型的生理及病理生理功能具有重要作用，进而建立COX亚型基因敲除小鼠的鉴定方法也就尤为重要[2]。目前，国内基因敲除小鼠鉴定中DNA的提取主要有两种方法，第一种即采用蛋白酶K消化后用经典酚氯仿提取法：通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质，再加入乙醇即可使DNA分离出来；第二种即基因组DNA试剂盒提取法：通过裂解细胞释放出基因组DNA，然后加入核糖核酸酶A去除RNA，接着选择性沉淀去除蛋白，最后通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液[3-4]。碱性裂解液提取DNA法鲜见报道。因此，本实验将建立一种用碱性裂解液提取DNA的方法，为COX亚型基因敲除小鼠鉴定提供更为方便、经济、快速的方法[5]。
1 资料与方法
1.1 一般资料 实验动物：COX亚型基因敲除小鼠引进于北京大学医学部生理系，基因背景为COX-1+/-的杂合子小鼠2雌1雄，基因背景为COX-2+/-的杂合子小鼠2雌1雄，共6只。试剂：PCR试剂盒、DNA marker购自大连宝生物工程有限公司；PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成；重要溶液地配制：溶液A，即NaOH溶液，成分为25 mmol/L NaOH、2 mmol/L EDTA，溶液B的成分为40 mmol/L Tris·HCl，pH值为8.0。仪器：干式恒温器（奥盛仪器有限公司，中国），PCR扩增仪（ABI公司，美国），电泳仪（北京六一仪器厂，中国）。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA提取 COX基因敲除小鼠按照SPF级动物饲养标准进行饲养。温度控制在22 ℃，光照周期为12 h黑暗，12 h光照；笼具、垫料、饲料和饮水均经过高温高压灭菌处理后使用；自由取食和饮水，垫料一周更换两次。采用1雄和2雌合笼方式进行繁殖。在子代小鼠断乳打耳号进行标记时，留取小鼠耳缘组织于1.5 mL EP管中，加入100 μL溶液A，于干式恒温器100 ℃孵育30 min。再加入100 μL溶液B，充分震荡混匀、离心，放入4 ℃冰箱备用。
1.2.2 基因组DNA扩增 （1）COX-1引物序列：WT-S：
5’-AGGAGATGGCTGCTGAGTTGG-3’，KO-S：5-’GCAGCCTCTGTTCCACATACAC-3’，WT/KO-AS：5’-AATCTGACTTTCTGAGTTGCC-3’。目的基因片段长度为601 bp。各种基因型小鼠扩增片段为：COX-1-/-：646 bp；COX-1+/-：601 bp和646 bp；COX-1+/+：601 bp。COX-2引物序列：WT-S：5’-ACACACTCTATCACTGGCACC-3’，KO-S：5’-ACGCGTCACCTTAATATGCG-3’，WT/KO-AS：5’-ATCCCTTCACTAAATGCCCTC-3’。目的基因片段长度为905 bp。各种基因型小鼠扩增片段为：COX-2-/-：905 bp；COX-2+/-：760 bp和905 bp；COX-2+/+：760 bp。（2）PCR体系：2× Go Taq Green Master Mix 12.5 μL，引物WT-S（10 μmol/L）2.5 μL，引物KO-S（10 μmol/L）2.5 μL，引物WT/KO-AS（10 μmol/L）2.5 μL， 耳缘DNA模板样品1.5 μL，ddH2O补足25 μL。（3）COX-1反应条件：①预变性94 ℃，5 min；②变性94 ℃，30 s；③退火56 ℃，30 s；④延伸72 ℃，30 s，重复步骤②～④40次循环；⑤最后延伸72 ℃，7 min；⑥4 ℃保存。（4）COX-2反应条件：①预变性94 ℃，5 min；②变性94 ℃，45 s；③退火56 ℃，45 s；④延伸72 ℃，45 s，重复步骤②～④35次循环；
⑤最后延伸72 ℃，7 min；⑥4 ℃保存。
1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 用TBE缓冲液配制1.2%琼脂糖凝胶，待60 ℃左右加入溴化乙啶 （EB） 2 μL （10 mg/mL），混匀后，倒入凝胶板铺板，室温放置30 min，待凝胶完全凝固后放入电泳槽，加入PCR产物10 μL于点样孔，调节电泳电压为100 V，电泳40 min后，观察结果。
2 结果
COX-1子代基因鉴定部分结果如图1所示，凝胶最左侧为Marker，编号2、5、6可见大小为646 bp左右的条带，为纯合子；编号1、3、4、7可见大小为646 bp和601 bp左右的条带，为杂合子；编号8可见大小为601 bp左右的条带，为野生型。 COX-2子代基因鉴定部分结果如图2所示，凝胶最左侧为Maker，编号3可见大小为905 bp左右的条带，为纯合子；编号1、2、4可见大小为905 bp和760 bp左右的条带，为杂合子；编号5可见大小为760 bp左右的条带，为野生型。
3 讨论
小鼠基因敲除技术是研究整体动物水平基因功能的一种直接有效方法，通过基因敲除动物，可以直接分析被敲除基因的功能和作用[6]。目前，心血管系统中COX亚型的生理功能及其在病理状态下的变化尚需进一步明确。一般认为，COX-1为结构型，主要表达于正常组织，在维持肾脏血流和调节血小板聚集中具有重要作用[7]。COX-2为诱导型，又称“炎症反应基因”，正常生理状态下几乎不表达或少表达，当受到刺激后便迅速表达合成，参与多种病理生理过程[8]。深入研究COX在心血管系统的作用机制，有助于明确各种心血管疾病的发生发展机制[9]。
为了进一步确定COX-1和COX-2基因在心血管病理生理方面的功能和作用，本实验室引进了COX-1和COX-2基因敲除小鼠杂合子，严格按照SPF级标准进行小鼠的饲养和繁殖，由于杂合子交配所产生的子代可能出现3种基因型，即野生型（COX-1+/+；COX-2+/+）、杂合子（COX-1+/-；COX-2+/-）和纯合子（COX-1-/-；COX-2-/-），故必须对其子代进行基因鉴定，从而分辨出纯合子用于实验研究。经典酚氯仿提取法虽然用的都是实验室常用试剂，但是较碱性裂解液提取法费时费力，而且苯酚和氯仿还有一定毒性作用；试剂盒提取法提纯效率和纯度都比较高，但相比碱性裂解液提取法而言费用较高，且过程较之复杂。因此，本实验所采用的碱性裂解液提取法相比于经典酚氯仿提取法、试剂盒提取法具有处理过程简单、快捷、省时且经济等优点。通过对不同亚型的COX基因的鉴定，验证了该方法的可靠性。同时，在实验过程中笔者亦观察到：COX-1-/-雌鼠能怀孕但不能够分娩，而COX-2-/-雌鼠不能够受孕，与之前报道的结果一致[10]。故在COX基因亚型敲除小鼠繁殖过程中应采用杂合子雌鼠作为母鼠，才能得到纯合子的子鼠用于实验。
综上所述，碱性裂解液提取DNA法能很好地应用在不同基因型的COX基因亚型敲除小鼠的鉴定中，为基因敲除小鼠鉴定提供了一种便捷、可靠的方法。通过一段时间的繁育及鉴定，得到较多纯合子小鼠，为本实验室进行COX亚型对心血管疾病发生发展机制的研究提供了必要的条件。
参考文献
[1] Félétou M， Huang Y， Vanhoutte P M. Endothelium-mediated control of vascular tone： COX-1 and COX-2 products[J]. Br J Pharmacol， 2011， 164（3）：894-912.
[2]张子房，唐炜，尹江涛.环氧化酶-2、p53和Bcl-2在胃癌组织中的表达及其意义[J].中国医学创新，2009，6（17）：12-15.
[3]董子龙，庄然，张宇丝，等.PTA-1-/-/ApoE-/-双基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定[J].实验动物科学，2012，29（5）：6-8.
[4]杜智勇，粟永萍，杨天德，等.类固醇受体辅活化子-1基因敲除小鼠的繁殖与筛选[J].重庆医学，2007，36（4）：326-327.
[5] Zhang Y H，Huang B L，Eastman K，et al.Mouth cell collection device for newborn mice[J]. Mol Genet Metab，2006，89（12）：164-167.
[6]赵国阳，李光飞，徐又佳.基因敲除技术在骨质疏松相关基因研究中的应用[J].中国骨质疏松杂志，2011，17（8）：748-752.
[7]王燕杰.环氧合酶及其抑制剂与宫颈癌的关系[J].中国临床医学，2012，19（6）：703-704.
[8]张一弛，牟艳玲，解砚英.COX-2与糖尿病并发症关系[J].研究进展生命科学，2012，24（1）：63-68.
[9]蒋跃绒，殷惠军，陈可冀.环氧合酶与心血管疾病[J].心血管病学进展，2006，27（5）：627-630.
[10] St-Louis I， Singh M， Brasseur K，et al.Expression of COX-1 and COX-2 in the endometrium of cyclic，pregnant and in a model of pseudopregnant rats and their regulation by sex steroids[J]. Reprod Biol Endocrinol，2010，24（8）：103.
（收稿日期：2013-11-13） （本文编辑：黄新珍）