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摘要：目的 建立黑龙江和河北地区大青叶蛋白指纹图谱，为不同地区大青叶的鉴别和质量评价提供依据。方法 采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术，对黑龙江和河北地区的大青叶样品进行鉴别。结果 河北大青叶蛋白亚基的最大分子质量为168.2 kD，最小为19.8 kD，亚基1、6含量最高；黑龙江大庆大青叶蛋白亚基的最大分子质量为175 kD，最小为24.4 kD，亚基1、2、4含量最高；黑龙江哈尔滨大青叶蛋白亚基的最大分子质量为175 kD，最小为27.7 kD，亚基1、3含量最高。结论 SDS-PAGE技术可以用于鉴别不同地区大青叶。
关键词：大青叶；鉴别；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.021
中圖分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0076-03
Analysis on Isatidis Folium Protein in Heilongjiang and Hebei Provinces by SDS-PAGE SHI Lian-hong， YANG Xin， ZHAI Chun-mei， MENG Yong-hai （Key Laboratory of Basic and Application Research of North Chinese Medicine of the Ministry of Education， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjang Key Laboratory of Pharmacodynamic Material Bases of TCM and Nature Medicine， Harbin 150040， China）
Abstract：Objective To build fingerprint of Isatidis Folium protein in Heiongjiang and Hebei Provinces；To provide the basis for the identification and quality evaluation of Isatidis Folium. Methods SDS-PAGE technology was used to identify the samples of Isatidis Folium protein in Heiongjiang and Hebei Provinces. Results Maximum molecular quality of Isatidis Folium protein subunit in Hebei Province was 168.2 kD， and the minimum was 19.8 kD. The subunit 1 and 6 had the highest contents. Maximum molecular quality of Isatidis Folium protein subunit in Daqing area was 175 kD， and the minimum was 24.4 kD. The subunit 1， 2 and 4 had the highest contents. Maximum molecular quality of Isatidis Folium protein subunit in Harbin area was 175 kD， and the minimum was 27.7 kD. The subunit 1 and 3 had the highest contents. Conclusion SDS-PAGE technology can be used to identify Isatidis Folium in different areas.
Key words：Isatidis Folium；identify；SDS-PAGE
根据《中华人民共和国药典》，正品板蓝根为十字花科菘蓝属植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，菘蓝的干燥叶为大青叶[1]。板蓝根与大青叶性味相似，均为味苦、性寒，均有药用功效和经济价值，
基金项目：黑龙江省自然科学基金面上项目（H201473）；黑龙江省博士后资助课题（LBH-Z12259）；黑龙江省教育厅科研课题（12531622）；黑龙江中医药大学优秀青年教师支持计划项目（2012RCQ16）
通讯作者：孟永海，E-mail：124391407@qq.com
主要功效为凉血消肿、清热解毒，有抗内毒素的作用[2-3]。其不仅用于临床治疗，还可以预防疾病，应用非常广泛。本课题组前期建立了不同地区板蓝根十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）指纹图谱，明确了不同地区的板蓝根有差异性，也有相似性[4]。在此基础上，本研究建立不同地区大青叶SDS- PAGE指纹图谱，探讨其蛋白差异性。
1 仪器与试药
酶标仪MK3，Peikin Elmer；电泳仪和Universal HoodⅡ电泳自动成像仪，美国BIO-RAD生化科技有限公司；Mettler Toledo电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MIKRO220R离心机，HETTICH。
SDS-PAGE所用试剂为BIO-RAD生化科技有限公司产品，其他试剂为国产分析纯。大青叶样品产地分别为黑龙江哈尔滨、黑龙江大庆、河北省赵县，均为栽培品种，每个产地收集10个样品，经黑龙江中医药大学生药教研室王振月老师鉴定为十字花科菘蓝属植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥叶，采用硅胶快速干燥保存。 2 方法
2.1 植物蛋白提取
采用康为世纪植物蛋白提取试剂盒（货号CW2033），按照植物蛋白提取说明书进行操作。
2.2 BCA法测定蛋白浓度
参照文献[5]方法。稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品配制方法见表1。配制BCA工作液：BCA工作液总量=（BSA标准品样本个数+待测样品）×复孔数×每个样本BCA工作液体积。将稀释好的A～G管BSA标准品和待测蛋白样品各25 μL分别加到作好标记的96孔板微孔中，每个样本做2～3个平行反应。每孔加入BCA工作液200 μL，充分混匀，盖上96孔板盖，37 ℃孵育30 min。冷却至室温。用酶标仪在540～590 nm范围内测定每个样品及BSA标准品吸光值。绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。蛋白浓度检测范围：20～2000 μg/mL。
表1 BSA标准品的配制
管号 稀释液（μL） BSA标准品（μL） BSA标准品终浓度（μg/μL）
A 0 100 2
B 200 200 1
C 200 200（从B管中取） 0.5
D 200 200（从C管中取） 0.25
E 200 200（从D管中取） 0.125
F 200 200（从E管中取） 0.062 5
G 200 0 0
2.3 蛋白完整性检测
2.3.1 灌制5%分离胶 ①选择浓度5%PAGE分离胶，装配好凝胶模具。②将不同体积的30%Acr-Bis（29∶1）、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。③加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。④在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1～5 cm水层，使凝胶表面保持平整。⑤静置20 min，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，表明凝胶已聚合。
2.3.2 灌制10%浓缩胶 ①去除覆盖在分离胶上的水层。②将不同体积的30%Acr-Bis（29∶1）、浓缩胶缓冲液和双蒸水在一个小烧杯或试管中混合。③加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。④将浓缩胶溶液加至分离胶上，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。⑤将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。⑥静置10～20 min，等待浓缩胶聚合。⑦待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。⑧进行常规电泳操作[6-8]。
3 结果
3.1 蛋白定量检测和标准曲线绘制
以蛋白浓度（μg/μL）为横坐标，吸光值为纵坐标，用Excel制作标准曲线。根据公式Y=0.401X+0.051计算大青叶蛋白含量。结果黑龙江哈尔滨、大庆及河北地区大青叶蛋白含量分别为1.85、2.05、1.68 μg/μL。加裂解液保证3个地区蛋白浓度一致，为下一步SDS-PAGE做准备。
3.2 标准蛋白泳道和条带分析
应用SDS-PAGE技术对不同地区大青叶药材进行研究，黑龙江和河北地区大青叶蛋白的亚基分布见图1，用考马斯亮蓝G250染色后大青叶蛋白质条带清晰，没有出现拖尾现象，条带颜色越深说明蛋白含量越高，颜色越浅说明蛋白含量越低。标准蛋白所含亚基数约为11条，亚基的分子质量范围为10.5～175 kD。标准蛋白泳道和条带分析见表2。
3.3 不同地区大青叶蛋白泳道和条带分析
从图1可以看出，河北大青叶亚基数约为9条，亚基分子质量范围为19.8～168.2 kD，亚基1、6含量最高，见表3。黑龙江哈尔滨大青叶所含亚基数约为5条，亚基分子质量范围为27.7～175 kD，亚基1、3含量最高，见表4。黑龙江大庆大青叶所含亚基数约为7条，亚基的分子质量范围为24.4～175 kD，亚基1、2、4含量最高，见表5。
综上，不同地区板蓝根蛋白SDS-PAGE分离效果良好，黑龙江哈尔滨和大庆大青叶相同条带为175 kD，河北和黑龙江哈尔滨大青叶相同条带为67.7 kD，河北和黑龙江大庆大青叶相同条带为24.7 kD，河北大青叶特征条带为168.2、59.7、50.7、34.5、26.5、24.7、23.2、19.8 kD，黑龙江哈尔滨大青叶特征条带为57.8、43.4、27.7 kD，黑龙江大庆大青叶特征条带为138、62.7、45.5、37.1、31.2 kD。3个地区的大青叶有相似条带，也有特征条带。
4 讨论
为了减少组间差异，本研究对每个产地的大青叶10个样本混合后提取植物蛋白。由于黑龙江地区大青叶是从河北地区移栽而来，环境不同，因此选择和黑龙江地区的大青叶进行对比。经初步研究，，移栽的大青叶在蛋白水平上发生了变化，但是否影响药用价值尚需进一步研究。
本研究利用SDS-PAGE技术对不同产地大青叶样品进行研究，建立大青叶SDS-PAGE指纹图谱，结果充分显示了SDS-PAGE技术的优点。说明SDS-PAGE技术能够准确地将不同地区的大青叶完全区分开来。SDS-PAGE技术主要用于品种鉴定，尤其是在分子水平上鉴定中药材非常可靠，本研究进一步说明SDS-PAGE技术应用于中药材鉴定是可行的，为现代中药发展提供了实践意义和依据，为探求中药材的生物学实质提供了更为深入的线索。本研究在分子水平上为大青叶品种栽培、种质资源研究、质量评价、来源分析提供了试验依据。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：284.
[2] 武彦文，高文远，肖小河.大青葉的研究进展[J].中成药，2006，37（5）：793-795.
[3] 董娟娥，梁宗锁，尉芹，等.不同区域松蓝根、叶（板蓝根、大青叶）有效成分含量差异[J].应用生态学报，2006，17（9）：1613-1618.
[4] 杨欣，王秋红，邢娜，等.不同地区板蓝根蛋白SDS-PAGE分析[J].中国中医药信息杂志，2015，22（7）：86-88.
[5] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantities of microgram of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem，1976，72：248-254.
[6] 姜先刚，赵雨，张巍，等.人参水溶性蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹图谱研究[J].药物分析杂志，2008，28（6）：873-875.
[7] 陈宏，王振英，靳阳.用超敏感银染SDS-PAGE方法绘制黄瓜、菜豆蛋白质指纹图谱[J].华北农学报，2000，15（4）：108-111.
[8] 郑虎占，董泽宏，佘靖.中药现代研究与应用：第一卷[M].北京：学苑出版社，1997：323-324，328-335.
（收稿日期：2015-01-29）
（修回日期：2015-02-27；编辑：陈静）
关键词：大青叶；鉴别；十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.09.021
中圖分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）09-0076-03
Analysis on Isatidis Folium Protein in Heilongjiang and Hebei Provinces by SDS-PAGE SHI Lian-hong， YANG Xin， ZHAI Chun-mei， MENG Yong-hai （Key Laboratory of Basic and Application Research of North Chinese Medicine of the Ministry of Education， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjang Key Laboratory of Pharmacodynamic Material Bases of TCM and Nature Medicine， Harbin 150040， China）
Abstract：Objective To build fingerprint of Isatidis Folium protein in Heiongjiang and Hebei Provinces；To provide the basis for the identification and quality evaluation of Isatidis Folium. Methods SDS-PAGE technology was used to identify the samples of Isatidis Folium protein in Heiongjiang and Hebei Provinces. Results Maximum molecular quality of Isatidis Folium protein subunit in Hebei Province was 168.2 kD， and the minimum was 19.8 kD. The subunit 1 and 6 had the highest contents. Maximum molecular quality of Isatidis Folium protein subunit in Daqing area was 175 kD， and the minimum was 24.4 kD. The subunit 1， 2 and 4 had the highest contents. Maximum molecular quality of Isatidis Folium protein subunit in Harbin area was 175 kD， and the minimum was 27.7 kD. The subunit 1 and 3 had the highest contents. Conclusion SDS-PAGE technology can be used to identify Isatidis Folium in different areas.
Key words：Isatidis Folium；identify；SDS-PAGE
根据《中华人民共和国药典》，正品板蓝根为十字花科菘蓝属植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥根，菘蓝的干燥叶为大青叶[1]。板蓝根与大青叶性味相似，均为味苦、性寒，均有药用功效和经济价值，
基金项目：黑龙江省自然科学基金面上项目（H201473）；黑龙江省博士后资助课题（LBH-Z12259）；黑龙江省教育厅科研课题（12531622）；黑龙江中医药大学优秀青年教师支持计划项目（2012RCQ16）
通讯作者：孟永海，E-mail：124391407@qq.com
主要功效为凉血消肿、清热解毒，有抗内毒素的作用[2-3]。其不仅用于临床治疗，还可以预防疾病，应用非常广泛。本课题组前期建立了不同地区板蓝根十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）指纹图谱，明确了不同地区的板蓝根有差异性，也有相似性[4]。在此基础上，本研究建立不同地区大青叶SDS- PAGE指纹图谱，探讨其蛋白差异性。
1 仪器与试药
酶标仪MK3，Peikin Elmer；电泳仪和Universal HoodⅡ电泳自动成像仪，美国BIO-RAD生化科技有限公司；Mettler Toledo电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；MIKRO220R离心机，HETTICH。
SDS-PAGE所用试剂为BIO-RAD生化科技有限公司产品，其他试剂为国产分析纯。大青叶样品产地分别为黑龙江哈尔滨、黑龙江大庆、河北省赵县，均为栽培品种，每个产地收集10个样品，经黑龙江中医药大学生药教研室王振月老师鉴定为十字花科菘蓝属植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥叶，采用硅胶快速干燥保存。 2 方法
2.1 植物蛋白提取
采用康为世纪植物蛋白提取试剂盒（货号CW2033），按照植物蛋白提取说明书进行操作。
2.2 BCA法测定蛋白浓度
参照文献[5]方法。稀释牛血清白蛋白（BSA）标准品配制方法见表1。配制BCA工作液：BCA工作液总量=（BSA标准品样本个数+待测样品）×复孔数×每个样本BCA工作液体积。将稀释好的A～G管BSA标准品和待测蛋白样品各25 μL分别加到作好标记的96孔板微孔中，每个样本做2～3个平行反应。每孔加入BCA工作液200 μL，充分混匀，盖上96孔板盖，37 ℃孵育30 min。冷却至室温。用酶标仪在540～590 nm范围内测定每个样品及BSA标准品吸光值。绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。蛋白浓度检测范围：20～2000 μg/mL。
表1 BSA标准品的配制
管号 稀释液（μL） BSA标准品（μL） BSA标准品终浓度（μg/μL）
A 0 100 2
B 200 200 1
C 200 200（从B管中取） 0.5
D 200 200（从C管中取） 0.25
E 200 200（从D管中取） 0.125
F 200 200（从E管中取） 0.062 5
G 200 0 0
2.3 蛋白完整性检测
2.3.1 灌制5%分离胶 ①选择浓度5%PAGE分离胶，装配好凝胶模具。②将不同体积的30%Acr-Bis（29∶1）、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。③加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。④在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1～5 cm水层，使凝胶表面保持平整。⑤静置20 min，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面后，表明凝胶已聚合。
2.3.2 灌制10%浓缩胶 ①去除覆盖在分离胶上的水层。②将不同体积的30%Acr-Bis（29∶1）、浓缩胶缓冲液和双蒸水在一个小烧杯或试管中混合。③加入10%过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。④将浓缩胶溶液加至分离胶上，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。⑤将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。⑥静置10～20 min，等待浓缩胶聚合。⑦待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。⑧进行常规电泳操作[6-8]。
3 结果
3.1 蛋白定量检测和标准曲线绘制
以蛋白浓度（μg/μL）为横坐标，吸光值为纵坐标，用Excel制作标准曲线。根据公式Y=0.401X+0.051计算大青叶蛋白含量。结果黑龙江哈尔滨、大庆及河北地区大青叶蛋白含量分别为1.85、2.05、1.68 μg/μL。加裂解液保证3个地区蛋白浓度一致，为下一步SDS-PAGE做准备。
3.2 标准蛋白泳道和条带分析
应用SDS-PAGE技术对不同地区大青叶药材进行研究，黑龙江和河北地区大青叶蛋白的亚基分布见图1，用考马斯亮蓝G250染色后大青叶蛋白质条带清晰，没有出现拖尾现象，条带颜色越深说明蛋白含量越高，颜色越浅说明蛋白含量越低。标准蛋白所含亚基数约为11条，亚基的分子质量范围为10.5～175 kD。标准蛋白泳道和条带分析见表2。
3.3 不同地区大青叶蛋白泳道和条带分析
从图1可以看出，河北大青叶亚基数约为9条，亚基分子质量范围为19.8～168.2 kD，亚基1、6含量最高，见表3。黑龙江哈尔滨大青叶所含亚基数约为5条，亚基分子质量范围为27.7～175 kD，亚基1、3含量最高，见表4。黑龙江大庆大青叶所含亚基数约为7条，亚基的分子质量范围为24.4～175 kD，亚基1、2、4含量最高，见表5。
综上，不同地区板蓝根蛋白SDS-PAGE分离效果良好，黑龙江哈尔滨和大庆大青叶相同条带为175 kD，河北和黑龙江哈尔滨大青叶相同条带为67.7 kD，河北和黑龙江大庆大青叶相同条带为24.7 kD，河北大青叶特征条带为168.2、59.7、50.7、34.5、26.5、24.7、23.2、19.8 kD，黑龙江哈尔滨大青叶特征条带为57.8、43.4、27.7 kD，黑龙江大庆大青叶特征条带为138、62.7、45.5、37.1、31.2 kD。3个地区的大青叶有相似条带，也有特征条带。
4 讨论
为了减少组间差异，本研究对每个产地的大青叶10个样本混合后提取植物蛋白。由于黑龙江地区大青叶是从河北地区移栽而来，环境不同，因此选择和黑龙江地区的大青叶进行对比。经初步研究，，移栽的大青叶在蛋白水平上发生了变化，但是否影响药用价值尚需进一步研究。
本研究利用SDS-PAGE技术对不同产地大青叶样品进行研究，建立大青叶SDS-PAGE指纹图谱，结果充分显示了SDS-PAGE技术的优点。说明SDS-PAGE技术能够准确地将不同地区的大青叶完全区分开来。SDS-PAGE技术主要用于品种鉴定，尤其是在分子水平上鉴定中药材非常可靠，本研究进一步说明SDS-PAGE技术应用于中药材鉴定是可行的，为现代中药发展提供了实践意义和依据，为探求中药材的生物学实质提供了更为深入的线索。本研究在分子水平上为大青叶品种栽培、种质资源研究、质量评价、来源分析提供了试验依据。
参考文献：
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010：284.
[2] 武彦文，高文远，肖小河.大青葉的研究进展[J].中成药，2006，37（5）：793-795.
[3] 董娟娥，梁宗锁，尉芹，等.不同区域松蓝根、叶（板蓝根、大青叶）有效成分含量差异[J].应用生态学报，2006，17（9）：1613-1618.
[4] 杨欣，王秋红，邢娜，等.不同地区板蓝根蛋白SDS-PAGE分析[J].中国中医药信息杂志，2015，22（7）：86-88.
[5] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantities of microgram of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Anal Biochem，1976，72：248-254.
[6] 姜先刚，赵雨，张巍，等.人参水溶性蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹图谱研究[J].药物分析杂志，2008，28（6）：873-875.
[7] 陈宏，王振英，靳阳.用超敏感银染SDS-PAGE方法绘制黄瓜、菜豆蛋白质指纹图谱[J].华北农学报，2000，15（4）：108-111.
[8] 郑虎占，董泽宏，佘靖.中药现代研究与应用：第一卷[M].北京：学苑出版社，1997：323-324，328-335.
（收稿日期：2015-01-29）
（修回日期：2015-02-27；编辑：陈静）