【摘 要】
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目的研究miR-199a-5p靶向镁离子转运蛋白1（Magnesium transporter 1,MagT1）在慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染中引起T细胞功能耗竭的分子作用机制。方法①选取经临床确诊的慢性乙型肝炎患者10例,经检测其HBV-DNA检测值持续6月达1.0×10~5 IU/ml,且排除其它类型的病毒感染、肝硬化、肝癌等,并选取体检者10例作为正常
【基金项目】
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湖北省自然科学基金面上项目（2016CFC747）；
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目的研究miR-199a-5p靶向镁离子转运蛋白1（Magnesium transporter 1,MagT1）在慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染中引起T细胞功能耗竭的分子作用机制。方法①选取经临床确诊的慢性乙型肝炎患者10例,经检测其HBV-DNA检测值持续6月达1.0×10~5 IU/ml,且排除其它类型的病毒感染、肝硬化、肝癌等,并选取体检者10例作为正常对照组。②采集患者外周血,分离单个核细胞,用γ-干扰素（interferon gamma,IFN-γ）、白细胞介素2（interleukin 2,IL-2）、CD3抗体、白细胞介素1α（interleukin 1αlpha,IL-1α）活化T细胞;流式细胞仪进行T细胞亚群分析。③荧光定量逆转录聚合酶链反应（real-time reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测慢性HBV感染组与正常对照组T细胞中miR-199a-5p、程序性细胞死亡因子1（programmed cell death 1,PD-1）和MagT1基因表达情况。④双荧光素酶报告基因系统鉴定miR-199a-5p与MagT1的靶向关系。⑤构建包装miR-199a-5p/miR-199a-5p sponge慢病毒载体,感染T细胞后RT-qPCR分别检测慢病毒感染后T细胞miR-199a-5p、PD-1和MagT1基因表达;⑥Western blot检测慢病毒感染T细胞前后MagT1、PD-1蛋白表达水平。结果流式细胞仪检测表明慢性HBV感染组及正常对照组T细胞均活化成功。RT-qPCR检测表明慢性HBV感染组miR-199a-5p表达显著高于正常对照组（P＜0.01）,PD-1表达也显著高于正常对照组（P＜0.01）,但MagT1表达显著低于正常对照组（P＜0.01）。双荧光素酶报告基因系统证实miR-199a-5p靶向MagT1 3’UTR并抑制其表达（P＜0.05）。RT-qPCR检测表明慢病毒构建成功,miR-199a-5p/miR-199a-5p sponge分别显著上调或下调miR-199a-5p表达（P＜0.01）。上调miR-199a-5p表达后,RT-qPCR表明MagT1基因表达显著低于对照组（P＜0.01）,PD-1基因表达显著高于对照组（P＜0.01）,且正常对照组均高于HBV感染组（P＜0.01）;Western blot表明MagT1蛋白表达水平显著下降（P＜0.01）,PD-1蛋白水平显著升高（P＜0.01）,且正常对照组高于HBV感染组（P＜0.01）。下调miR-199a-5p表达后,MagT1表达量显著高于对照组（P＜0.05）,PD-1表达量显著低于对照组（P＜0.01）,且HBV感染组低于正常对照组（P＜0.01）;Western blot表明MagT1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）,PD-1蛋白水平显著降低（P＜0.01）,且HBV感染组低于正常对照组（P＜0.01）。结论在慢性HBV感染中,miR-199a-5p可以负向调节靶基因MagT1的表达,并对活化后T细胞功能耗竭具有重要的调节作用。
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