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摘要 目的：探讨黄连素对多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠卵巢血供的影响。方法：30只大鼠随机分为模型组、实验组和阳性对照组，采用脱氢表雄酮（DHEA）皮下注射构建PCOS大鼠;另选10只仅皮下注射大豆油作为对照组，1次/d，连续注射20 d。实验组和阳性对照组分别灌胃黄连素（80 mg/kg）和罗格列酮（3 mg/kg），模型组和对照组灌胃生理盐水（10 mL/kg），1次/d，连续干预22 d。检测大鼠血清睾酮（T）和游离睾酮（FT）含量，苏木精-伊红（HE）染色观察大鼠卵巢组织形态及微血管密度（MVD），原位杂交法与免疫组化法分别检测大鼠卵巢组织血管内皮生长因子（VEGF）mRNA水平与甾体类生成快速调节蛋白（StAR）蛋白表达。结果：模型组大鼠卵巢组织MVD、VEGF mRNA表达及StAR蛋白相对表达量较对照组升高，实验组和阳性对照组较模型组降低，且实验组低于阳性对照组（P<0.05）。结论：黄连素可通过调控PCOS大鼠卵巢组织血供及血管生成而改善卵巢组织形态，同时可通过下调StAR蛋白表达改善高雄激素血症。
关键词 多囊卵巢综合征;黄连素;卵巢血供;甾体类生成快速调节蛋白
Abstract Objective：To investigate the effects of berberine on ovarian blood supply in rats with polycystic ovarian syndrome （PCOS）.Methods：A total of 30 rats were randomly divided into a model group，a test group and a positive control group.Dehydroepiandrosterone （DHEA） subcutaneous injection was used to construct PCOS rats; another 10 rats were selected as the control group by subcutaneous injection of soybean oil，all were intervented once a day for 20 d continuously.The test group and positive control group were given by gavage with berberine 80 mg/kg and rosiglitazone 3 mg/kg respectively.The model group and control group were given 10 mL/kg normal saline by gavage，all were given once a day for consecutive 22 d.The content of testosterone （T） and free testosterone （FT） in serum of rats were detected.Hematoxylin-eosin （HE） staining was used to observe rat ovarian tissue morphology and microvessel density （MVD）.In situ hybridization and immunohistochemistry were used to detect vascular endothelial growth factor （VEGF） mRNA levels，producing rapid regulatory protein （StAR） protein expression with steroids.Results：The expression of MVD and VEGF mRNA and the relative expression of StAR protein in the ovarian tissue of the model group were higher than those of the control group，and the test group and the positive control group were lower than the model group.The experimental group was lower than the positive control group （P<0.05）.Conclusion：Berberine can improve ovarian morphology by regulating blood supply and angiogenesis in ovarian tissues of PCOS rats; and can improves hyperandrogenism by down-regulating the expression of StAR protein.
Keywords Polycystic ovary syndrome; Berberine; Ovarian blood supply; Producing rapid regulatory protein （StAR） protein expression with steroids
中图分类号：R285;R271.14 文獻标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.010
多囊卵巢综合征（Polycystic Ovarian Syndrome，PCOS）是常见的妇科生殖障碍性疾病，育龄妇女多发，以持续性无排卵、胰岛素抵抗（IR）及高雄激素为主要特征，也是造成女性不孕的主要诱因之一。黄连素又被称为小檗碱，是从多种中药中提取的异喹啉类生物碱，具有降糖降脂作用[1]，近年来研究发现，其还具有抑制雄激素合成的作用，而甾体类生成快速调节蛋白（StAR）是决定雄激素产生量和速度的关键蛋白。本研究探讨黄连素对PCOS大鼠卵巢血供及StAR蛋白表达的干预效果[2]。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 SPF级雌性SD大鼠，体质量160～220 g，购自山东绿叶制药有限公司，生产合格证号：SCXK（鲁）20130009。饲养条件：山东绿叶制药有限公司屏障环境动物实验室，光照明暗时间比为12 h/12 h，湿度（55±2）%，温度（25±2）℃，自由获取食物和水。
1.1.2 药物 黄连素（成都锦华药业有限责任公司，生产批号：121014）;脱氢表雄酮（DHEA）（湖北芳通药业有限公司，生产批号：15032516）;罗格列酮片（天方药业有限公司，生产批号：15120958）。
1.1.3 试剂与仪器 血睾酮（T）和游离睾酮（FT）测定试剂盒（DRG，德国，型号：EIA-2924）;血管内皮生长因子（VEGF）原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，型号：MK1142）;StAR免疫组化试剂盒（Santa Cruz公司，美国，型号：RS-3570R）;DVM5000 HD型高分辨显微镜（Leica公司，德国，型号：DVM5000 HD）;HM525冷冻切片机（MICROM公司，德国，型号：HM525）;BDNM-9602G自动酶标仪（Biotek公司，美国，型号：BDNM-9602G）等。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 40只大鼠随机分为对照组（n=10）、模型組（n=10）、阳性对照组（n=10）、实验组（n=10），通过皮下注射DHEA（60 mg/kg）、大豆油（0.2 mL·只）构建PCOS大鼠模型，对照组仅皮下注射大豆油，均1次/d，连续注射20 d，模型构建成功的标准：阴道上皮细胞连续2个性周期出现细胞角化现象，并失去动情周期[3]。
1.2.2 给药方法 实验组和阳性对照组分别灌胃黄连素（80 mg/kg）和罗格列酮（3 mg/kg），模型组和对照组灌胃生理盐水（10 mL/kg），1次/d，连续干预22 d。
1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测PCOS大鼠血清T和FT含量 干预结束后采集各组大鼠尾静脉血液2 mL，8 000 r/min离心5 min，离心半径16 cm，采用ELISA法检测大鼠血清T和FT含量。
1.2.3.2 苏木精-伊红（HE）染色法[4]观察PCOS大鼠卵巢组织形态学变化 采血后断头处死大鼠，取大鼠卵巢组织，经固定后常规制作石蜡切片，并行HE染色，观察大鼠卵巢组织形态学变化;并选取5个微血管密集区，观察微血管数目，取其均值表示微血管密度（MVD）。
1.2.3.3 原位杂交法[5]检测PCOS大鼠卵巢组织中VEGFmRNA水平 取各组大鼠卵巢组织制备冰冻切片，4%多聚甲醛室温固定0.5～1.0 h，暴露mRNA核酸片段，胃蛋白酶消化，每张切片加20 μL预杂交液，预杂交3 h后加20 μL VEGF寡核苷酸探针杂交液，杂交过夜，洗涤、封闭处理后，显色，封片。高倍镜下观察细胞形态、分布，细胞质着色呈棕黄色为VEGF mRNA阳性表达，采用BST-20-M全自动图像分析系统分析。
1.2.3.4 免疫组化[6]检测PCOS大鼠卵巢组织StAR蛋白表达情况 取卵巢组织石蜡切片，经预处理后，加StAR一抗，按照免疫组化试剂盒说明书进行操作。细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性着色，光学显微镜下判定染色结果。
1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，2组间比较进行t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血清T和FT含量比较 与对照组比较，模型组大鼠血清T和FT含量升高（P<0.05），与模型组比较，实验组和阳性对照组大鼠血清T和FT含量降低（P<0.05），且实验组血清T含量低于阳性对照组（P<0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠卵巢组织形态学变化及卵巢血供 对照组大鼠卵巢组织结构正常;模型组大鼠卵泡呈多囊性扩张，颗粒细胞层减少，且黄体数目较少;实验组和阳性对照组大鼠黄体数目增多，可见各个发育阶段的卵泡，颗粒细胞层数目较模型组增多。见图1。与对照组比较，模型组大鼠卵巢组织MVD升高，VEGF mRNA表达增强（P<0.05），而实验组和阳性对照组卵巢组织MVD较模型组降低，VEGF mRNA表达减弱，其中实验组卵巢组织MVD较阳性对照组降低，VEGF mRNA表达减弱（P<0.05）。见表2。
2.3 大鼠卵巢组织StAR蛋白表达 对照组、模型组、实验组和阳性对照组StAR蛋白相对表达量（个·mm2）为（1.43±0.21）、（6.54±0.36）、（2.42±0.56）、（3.28±0.39），模型组StAR蛋白相对表达量较对照组升高，实验组和阳性对照组较模型组降低（P<0.05），且实验组低于阳性对照组（P<0.05）。见图2。
3 讨论
卵巢生长、黄体形成均依赖于毛细血管增生，血管生成也是正常周期性卵巢的重要功能，同时黄体细胞对胆固醇合成孕酮发挥关键作用。研究认为，PCOS无排卵或排卵障碍的重要原因为间质及囊泡血管生成增多[7]。VEGF可通过促进毛细血管生成等而参与卵泡发育、成熟及排卵过程，VEGF mRNA转录增加可提高微血管通透性，引起排卵过程中卵泡壁破裂，最终导致PCOS的发生;且报道显示，PCOS大鼠卵巢组织及血清中VEGF mRNA表达均较正常大鼠明显升高[8]。本研究中同样显示出，模型组大鼠卵巢组织MVD升高，VEGF mRNA表达增强，而经药物干预后实验组和阳性对照组卵巢组织MVD降低，VEGF mRNA表达减弱。表明黄连素干预能有效调控PCOS大鼠卵巢组织血供及血管生成进而改善卵巢组织形态。 卵泡膜细胞产生IR后雄激素合成能力显著增强，黄连素能降低卵泡膜细胞的雄激素合成;黄连素还能降低地塞米松诱导的卵泡膜细胞模型的IR程度和雄激素合成水平，对PCOS有良好的治疗作用[9-10]。本研究中模型组大鼠血清T和FT含量较对照组升高，實验组大鼠血清中T和FT含量较模型组降低，表明PCOS模型大鼠处于高雄激素血症状态，而经黄连素干预后大鼠雄性激素水平普遍降低，表明黄连素可降低PCOS模型大鼠较高的雄激素水平。免疫组化染色可看到PCOS大鼠卵泡膜细胞膜上StAR表达活跃，其可加速胆固醇合成雄激素的进程，从而导致高雄激素血症，而经药物干预后，实验组和阳性对照组StAR表达量明显降低，有研究报道，黄连素也具有一定的降脂作用，因此黄连素是否能通过其他途径降低雄激素水平尚需进一步研究[9]。
参考文献
[1]朱铁梁，杨波，郭一沙，等.黄连素对高脂血症大鼠降血脂及抗氧化作用[J].中国应用生理学杂志，2017，33（4）：369-372.
[2]邵晓曼.黄连素联合桂枝茯苓丸对多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗患者的临床研究[J].中国临床研究，2013，26（8）：803-805.
[3]Manneras L，Cajander S，Holmang A，et al.A new rat model exhibiting both ovarian and metabolic characteristics of polycystic ovary syndrome[J].Endocrinol，2007，148（8）：3781-3791.
[4]黄雪君，孙冬梅，陈玉兴，等.护卵颗粒对重复制动应激致卵巢功能减退模型大鼠的影响[J].世界中医药，2016，11（3）：502-506.
[5]钱雅婧，聂晶，潘旭，等.正畸力作用下大鼠牙周组织白细胞介素6 mRNA的表达[J].中国组织工程研究，2013，17（50）：8672-8677.
[6]孙晓峰，阳松威，贺又舜，等.左归丸对化疗性卵巢早衰小鼠卵巢组织中缝隙连接蛋白43表达的影响[J].中国药房，2017，28（22）：3044-3047.
[7]Carmina E，Napoli Nlongo R A，Rini GB，et al.Metabolic syndrome in polycystic ovary syndrome（PCOS）：lower prevalence in southern Italy than in the USA and the influence of criteria for the diagnosis of PCOS[J].Eur J Endocrinol，2016，154（1）：141-145.
[8]姚菲，曹建雄，王若光.桂枝挥发油对PCOS大鼠模型卵巢VEGF、COX-2及MVD表达的影响[J].中医药导报，2012，18（1）：15-17.
[9]高磊，李威，匡洪影，等.小檗碱和葛根素对地塞米松诱导卵泡膜细胞胰岛素抵抗的影响[J].中国中西医结合杂志，2009，29（7）：623-627.
[10]Zhao L，Li W，Han F，et al.Berberine reduces insulin resistance induced by dexamethasone in theca cells in vitro[J].Fert Ster，2011，95（1）：461-461.
（2020-08-14收稿 责任编辑：苍宁）
关键词 多囊卵巢综合征;黄连素;卵巢血供;甾体类生成快速调节蛋白
Abstract Objective：To investigate the effects of berberine on ovarian blood supply in rats with polycystic ovarian syndrome （PCOS）.Methods：A total of 30 rats were randomly divided into a model group，a test group and a positive control group.Dehydroepiandrosterone （DHEA） subcutaneous injection was used to construct PCOS rats; another 10 rats were selected as the control group by subcutaneous injection of soybean oil，all were intervented once a day for 20 d continuously.The test group and positive control group were given by gavage with berberine 80 mg/kg and rosiglitazone 3 mg/kg respectively.The model group and control group were given 10 mL/kg normal saline by gavage，all were given once a day for consecutive 22 d.The content of testosterone （T） and free testosterone （FT） in serum of rats were detected.Hematoxylin-eosin （HE） staining was used to observe rat ovarian tissue morphology and microvessel density （MVD）.In situ hybridization and immunohistochemistry were used to detect vascular endothelial growth factor （VEGF） mRNA levels，producing rapid regulatory protein （StAR） protein expression with steroids.Results：The expression of MVD and VEGF mRNA and the relative expression of StAR protein in the ovarian tissue of the model group were higher than those of the control group，and the test group and the positive control group were lower than the model group.The experimental group was lower than the positive control group （P<0.05）.Conclusion：Berberine can improve ovarian morphology by regulating blood supply and angiogenesis in ovarian tissues of PCOS rats; and can improves hyperandrogenism by down-regulating the expression of StAR protein.
Keywords Polycystic ovary syndrome; Berberine; Ovarian blood supply; Producing rapid regulatory protein （StAR） protein expression with steroids
中图分类号：R285;R271.14 文獻标识码：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.010
多囊卵巢综合征（Polycystic Ovarian Syndrome，PCOS）是常见的妇科生殖障碍性疾病，育龄妇女多发，以持续性无排卵、胰岛素抵抗（IR）及高雄激素为主要特征，也是造成女性不孕的主要诱因之一。黄连素又被称为小檗碱，是从多种中药中提取的异喹啉类生物碱，具有降糖降脂作用[1]，近年来研究发现，其还具有抑制雄激素合成的作用，而甾体类生成快速调节蛋白（StAR）是决定雄激素产生量和速度的关键蛋白。本研究探讨黄连素对PCOS大鼠卵巢血供及StAR蛋白表达的干预效果[2]。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 SPF级雌性SD大鼠，体质量160～220 g，购自山东绿叶制药有限公司，生产合格证号：SCXK（鲁）20130009。饲养条件：山东绿叶制药有限公司屏障环境动物实验室，光照明暗时间比为12 h/12 h，湿度（55±2）%，温度（25±2）℃，自由获取食物和水。
1.1.2 药物 黄连素（成都锦华药业有限责任公司，生产批号：121014）;脱氢表雄酮（DHEA）（湖北芳通药业有限公司，生产批号：15032516）;罗格列酮片（天方药业有限公司，生产批号：15120958）。
1.1.3 试剂与仪器 血睾酮（T）和游离睾酮（FT）测定试剂盒（DRG，德国，型号：EIA-2924）;血管内皮生长因子（VEGF）原位杂交试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，型号：MK1142）;StAR免疫组化试剂盒（Santa Cruz公司，美国，型号：RS-3570R）;DVM5000 HD型高分辨显微镜（Leica公司，德国，型号：DVM5000 HD）;HM525冷冻切片机（MICROM公司，德国，型号：HM525）;BDNM-9602G自动酶标仪（Biotek公司，美国，型号：BDNM-9602G）等。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型制备 40只大鼠随机分为对照组（n=10）、模型組（n=10）、阳性对照组（n=10）、实验组（n=10），通过皮下注射DHEA（60 mg/kg）、大豆油（0.2 mL·只）构建PCOS大鼠模型，对照组仅皮下注射大豆油，均1次/d，连续注射20 d，模型构建成功的标准：阴道上皮细胞连续2个性周期出现细胞角化现象，并失去动情周期[3]。
1.2.2 给药方法 实验组和阳性对照组分别灌胃黄连素（80 mg/kg）和罗格列酮（3 mg/kg），模型组和对照组灌胃生理盐水（10 mL/kg），1次/d，连续干预22 d。
1.2.3 检测指标与方法
1.2.3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测PCOS大鼠血清T和FT含量 干预结束后采集各组大鼠尾静脉血液2 mL，8 000 r/min离心5 min，离心半径16 cm，采用ELISA法检测大鼠血清T和FT含量。
1.2.3.2 苏木精-伊红（HE）染色法[4]观察PCOS大鼠卵巢组织形态学变化 采血后断头处死大鼠，取大鼠卵巢组织，经固定后常规制作石蜡切片，并行HE染色，观察大鼠卵巢组织形态学变化;并选取5个微血管密集区，观察微血管数目，取其均值表示微血管密度（MVD）。
1.2.3.3 原位杂交法[5]检测PCOS大鼠卵巢组织中VEGFmRNA水平 取各组大鼠卵巢组织制备冰冻切片，4%多聚甲醛室温固定0.5～1.0 h，暴露mRNA核酸片段，胃蛋白酶消化，每张切片加20 μL预杂交液，预杂交3 h后加20 μL VEGF寡核苷酸探针杂交液，杂交过夜，洗涤、封闭处理后，显色，封片。高倍镜下观察细胞形态、分布，细胞质着色呈棕黄色为VEGF mRNA阳性表达，采用BST-20-M全自动图像分析系统分析。
1.2.3.4 免疫组化[6]检测PCOS大鼠卵巢组织StAR蛋白表达情况 取卵巢组织石蜡切片，经预处理后，加StAR一抗，按照免疫组化试剂盒说明书进行操作。细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性着色，光学显微镜下判定染色结果。
1.3 统计学方法 采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，2组间比较进行t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血清T和FT含量比较 与对照组比较，模型组大鼠血清T和FT含量升高（P<0.05），与模型组比较，实验组和阳性对照组大鼠血清T和FT含量降低（P<0.05），且实验组血清T含量低于阳性对照组（P<0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠卵巢组织形态学变化及卵巢血供 对照组大鼠卵巢组织结构正常;模型组大鼠卵泡呈多囊性扩张，颗粒细胞层减少，且黄体数目较少;实验组和阳性对照组大鼠黄体数目增多，可见各个发育阶段的卵泡，颗粒细胞层数目较模型组增多。见图1。与对照组比较，模型组大鼠卵巢组织MVD升高，VEGF mRNA表达增强（P<0.05），而实验组和阳性对照组卵巢组织MVD较模型组降低，VEGF mRNA表达减弱，其中实验组卵巢组织MVD较阳性对照组降低，VEGF mRNA表达减弱（P<0.05）。见表2。
2.3 大鼠卵巢组织StAR蛋白表达 对照组、模型组、实验组和阳性对照组StAR蛋白相对表达量（个·mm2）为（1.43±0.21）、（6.54±0.36）、（2.42±0.56）、（3.28±0.39），模型组StAR蛋白相对表达量较对照组升高，实验组和阳性对照组较模型组降低（P<0.05），且实验组低于阳性对照组（P<0.05）。见图2。
3 讨论
卵巢生长、黄体形成均依赖于毛细血管增生，血管生成也是正常周期性卵巢的重要功能，同时黄体细胞对胆固醇合成孕酮发挥关键作用。研究认为，PCOS无排卵或排卵障碍的重要原因为间质及囊泡血管生成增多[7]。VEGF可通过促进毛细血管生成等而参与卵泡发育、成熟及排卵过程，VEGF mRNA转录增加可提高微血管通透性，引起排卵过程中卵泡壁破裂，最终导致PCOS的发生;且报道显示，PCOS大鼠卵巢组织及血清中VEGF mRNA表达均较正常大鼠明显升高[8]。本研究中同样显示出，模型组大鼠卵巢组织MVD升高，VEGF mRNA表达增强，而经药物干预后实验组和阳性对照组卵巢组织MVD降低，VEGF mRNA表达减弱。表明黄连素干预能有效调控PCOS大鼠卵巢组织血供及血管生成进而改善卵巢组织形态。 卵泡膜细胞产生IR后雄激素合成能力显著增强，黄连素能降低卵泡膜细胞的雄激素合成;黄连素还能降低地塞米松诱导的卵泡膜细胞模型的IR程度和雄激素合成水平，对PCOS有良好的治疗作用[9-10]。本研究中模型组大鼠血清T和FT含量较对照组升高，實验组大鼠血清中T和FT含量较模型组降低，表明PCOS模型大鼠处于高雄激素血症状态，而经黄连素干预后大鼠雄性激素水平普遍降低，表明黄连素可降低PCOS模型大鼠较高的雄激素水平。免疫组化染色可看到PCOS大鼠卵泡膜细胞膜上StAR表达活跃，其可加速胆固醇合成雄激素的进程，从而导致高雄激素血症，而经药物干预后，实验组和阳性对照组StAR表达量明显降低，有研究报道，黄连素也具有一定的降脂作用，因此黄连素是否能通过其他途径降低雄激素水平尚需进一步研究[9]。
参考文献
[1]朱铁梁，杨波，郭一沙，等.黄连素对高脂血症大鼠降血脂及抗氧化作用[J].中国应用生理学杂志，2017，33（4）：369-372.
[2]邵晓曼.黄连素联合桂枝茯苓丸对多囊卵巢综合征伴胰岛素抵抗患者的临床研究[J].中国临床研究，2013，26（8）：803-805.
[3]Manneras L，Cajander S，Holmang A，et al.A new rat model exhibiting both ovarian and metabolic characteristics of polycystic ovary syndrome[J].Endocrinol，2007，148（8）：3781-3791.
[4]黄雪君，孙冬梅，陈玉兴，等.护卵颗粒对重复制动应激致卵巢功能减退模型大鼠的影响[J].世界中医药，2016，11（3）：502-506.
[5]钱雅婧，聂晶，潘旭，等.正畸力作用下大鼠牙周组织白细胞介素6 mRNA的表达[J].中国组织工程研究，2013，17（50）：8672-8677.
[6]孙晓峰，阳松威，贺又舜，等.左归丸对化疗性卵巢早衰小鼠卵巢组织中缝隙连接蛋白43表达的影响[J].中国药房，2017，28（22）：3044-3047.
[7]Carmina E，Napoli Nlongo R A，Rini GB，et al.Metabolic syndrome in polycystic ovary syndrome（PCOS）：lower prevalence in southern Italy than in the USA and the influence of criteria for the diagnosis of PCOS[J].Eur J Endocrinol，2016，154（1）：141-145.
[8]姚菲，曹建雄，王若光.桂枝挥发油对PCOS大鼠模型卵巢VEGF、COX-2及MVD表达的影响[J].中医药导报，2012，18（1）：15-17.
[9]高磊，李威，匡洪影，等.小檗碱和葛根素对地塞米松诱导卵泡膜细胞胰岛素抵抗的影响[J].中国中西医结合杂志，2009，29（7）：623-627.
[10]Zhao L，Li W，Han F，et al.Berberine reduces insulin resistance induced by dexamethasone in theca cells in vitro[J].Fert Ster，2011，95（1）：461-461.
（2020-08-14收稿 责任编辑：苍宁）