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摘要：目的：了解云南省艾滋病病毒（HIV-1）的耐药基因变异情况。方法：从2011年云南省进行艾滋病抗病毒治疗一年以上，病毒载量>1000copies/mL的患者中进行筛选，分析人口学及流行病学特征并进行基因型耐药性检测。结果：其中280例扩增阳性。在280份序列中，蛋白酶抑制剂（PIs）耐药发生率为4.64%；核苷（酸）类反转录酶抑制剂（NRTIs）耐药发生率为59.29%，尤其是3TC和FTC；非核苷类反转录酶抑制剂（NNRTIs）耐药发生率为88.93%，尤其是NVP和EFV。较高的耐药突变为M184V、D67N、K70R、K103N、Y181C和G190A。结论：云南省艾滋病患者对NRTIs和NNRTIs耐药发生率较高，对PIs耐药发生率还处于较低水平。及时掌握艾滋病患者的耐药基因突变情况，对于指导临床用药尤为重要。
关键词：艾滋病；HIV-1；耐药
大多数艾滋病患者在开始抗病毒治疗后的半年内，病毒载量已达到检测不到的水平。但是，还有部分患者的病毒载量依然处于较高的水平，这意味着抗病毒治疗失败。影响抗病毒治疗效果的因素很多，HIV-1病毒产生的耐药性就是一个主要的因素。HIV耐药毒株的产生和传播使得艾滋病治疗工作的可持续性面临严峻的挑战[1]。因此及时对艾滋病患者耐药情况进行分析，探讨基因突变对抗病毒治疗的影响，对艾滋病防治和监测具有重大意义。本次研究将对云南省艾滋病治疗失败患者耐药情况进行分析。
1 对象与方法
1.1 对象 从2011年云南省进行抗病毒治疗的HIV患者中筛选。入选标准：开展艾滋病抗病毒治疗半年以上，病毒载量≥1000copies/mL。
1.2 方法
1.2.1 从2011年云南省进行艾滋病抗病毒治疗六个月以上，病毒载≥1000copies/ml的患者中进行筛选，采集全血分离血浆进行Bayer VERSANTTM 440 Molecular System测定病毒载量，同时采集病人的流行病学信息，分析人口学及流行病学特征，美国ABI公司9700PCR扩增仪进行反转录套式聚合酶链反应（Reverse Transcription—Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）扩增，扩增产物送至北京博迈德公司测序，测序结果提交至美国斯坦福大学HIV耐药数据库（http：//hivdb.stanford.edu）分析耐药突变情况。
2 结果
2.1 样本流行病学资料分析：共获得280例流行病学资料完整的样本。280例艾滋病患者男女比例为1.72/1：年龄在19-72岁，平均年龄45岁；93.93%的患者抗病毒治疗时间在1年以上；传播途径以异性传播为主（54.29%），同性传播为男男同性性传播（1.07%），已婚或同居患者占多数（65.71%）；93.93%的患者抗病毒治疗时间在1年以上；药物治疗方案3TC+AZT+NVP为主（34.64%）。
2.2 耐药基因情况
2.2.1 PIs耐药突变结果：有13份存在蛋白酶抑制剂（PIs）耐药突变，突变率为4.64%（13/280）。PI相关突变位点有7个，分别为L33F（2.50%，7/280），V82A（1.07%，3/280），M46I和L76V均为2例（0.71%，2/280），V82F、N88D和I54V均为1例（0.36%，1/280）。
2.2.2 NNRTIs耐药突变结果：有166份存在核苷（酸）类反转录酶抑制剂（NRTIs）耐药突变，耐药突变率为59.29%（166/280）。NRTIs相关突变位点有21个，分别为M184V（51.07%，143/280），D67N（12.14%，34/280），K70R（10.71%，30/280），M41L（8.57%，24/280），T215Y（7.50%，21/280），T215F（7.14%，20/280），A62V（5.0%，14/280），K219E、K219Q和L210W均为11例（3.93%，11/280），V75I（2.86%，8/280），K65R（2.14%，6/280），M184I和V75M均为5例（1.79%，5/280），T69Ins（1.07%，3/280），Q151M和F116Y均为2例（0.71%，2/280），L74V、F77L、Y115F和L74I均为1例（0.36%，1/280）。
2.2.3 NRTIs耐药突变结果：有249份存在非核苷类反转录酶抑制剂（NNRTIs）耐药突变，耐药突变率为88.93%（249/280）。NNRTIs相关突变位点有19个，分别为K103N（34.64%，97/280），Y181C（24.64%，69/280），G190A（23.21%，65/280），V179D（13.93%，39/280），A98G（9.29%，26/280），K101E（7.5%，21/280），V106M和P225H均为17例（6.07%，7/280），V108I（5%，14/280），F227L（3.21%，9/280），V179E（2.86%，8/280），V106A和M230L均为7例（2.5%，7/280），G190S（2.14%，6/280），K103S和K238T均为4例（1.43%，4/280），Y188L（1.07%，3/280），K101P和Y188C均为2例（0.71%，2/280），Y188H（0.36%，1/280）。
2.3 对抗病毒药物的耐药情况
280例艾滋病患者中，有146例（52.14%）对NRTIs出现了不同程度的耐药，有220例（78.57%）对NNRTIs出现了不同程度的耐药，有10例（3.57%）对PIs出现了不同程度的耐药。280例艾滋病患者具体耐药情况。 3 讨论
3.1 一般情况分析：从传播途径来看，性传播是主要的传播途径（包括同性和异性传播，占56.27%），这可能是一些地州对不洁性行为危害的健康教育宣传力度还不够大。从年龄来看，50岁以上患者比例为11.43%，随着HAART的广泛应用，艾滋病患者的存活周期延长，这可能是导致中老年感染者增加的原因。
3.2 经过检测发现，PIs的耐药性突变较其他药物多，且作用机制十分复杂。此次研究发现蛋白酶区主要耐药突变位点为：M46I。M46I可导致ATV/r（阿扎那韦）的敏感性丧失，可引起除SQV/r以外的其他PIs类药物敏感性降低。引起PIs交叉耐药的主要突变位点是V82A/F和M46I。在接受IDV/r的患者中常出现V82A/F。M46I和I54V常出现在接受IDV/r和NFV治疗的患者中。因N88D对PIs极少有交叉耐药，所以NFV治疗后出现耐药的患者常对含另一个不同PIs的治疗方案敏感。在这次云南省2011年耐药基因的研究中发生PIs基因耐药位点突变的患者主要以次要耐药位点突变为主。体外研究表明，蛋白酶基因区次要突变单独或者联合出现都不能导致治疗的失败，只有与主要突变同时存在时，才能降低对药物的敏感性[2]。蛋白酶类药物的耐药率较低，可能是云南省蛋白酶类药物目前在抗病毒治疗中应用较少，还未对病毒形成足够大的药物选择压力。
最常见的NRTIs耐药性突变是M184V，因为治疗方案中几乎都使用了3TC，所以出现针对3TC的M184V突变率最高。研究发现，81%治疗失败的患者会发生M184V突变[3]。当3TC作为HAART方案中的一种药物时，M184V总是首先出现。M184V往往导致病人对3TC和FTC的高度耐药[4]，并能增加AZT、ddI以及TDF的敏感性[5]。检测结果显示HIV-1对FTC的耐药率为49.64%，而在用药方案中并无患者使用FTC，这是由于3TC作为治疗用药时，发生耐药突变时最早出现的耐药位点是M184V[6]，而M184V在导致3TC产生高度耐药的同时也会对FTC产生高度耐药。在含D4T和ddI方案治疗失败后常出现Q151M复合体。A62V、V75I和F116Y包括在Q151M耐药复合体中，它们对AZT、D4T和ABC产生的高度耐药[7]，对TDF、3TC和FTC产生中度耐药。
NNRTIs的耐药屏障很低，1至2个突变就可导致高度耐药。K103N、G190A和Y181C是3个非常重要的耐药突变位点。在耐药患者中，K103N发生率达8.5%[8-9]，且具有较高的复制能力和复制适应性[10]。研究显示，低频的K103N可用来预测治疗是否失败[11]。Y181C的单独突变即可引起NVP的高度耐药，且无耐药位点的积累。含NVP的治疗方案中常发生Y181C突变，而使用EFV方案的则相对较少出现Y181C突变[12]。V106A能导致NVP耐药性增加30倍。G190A/S单独突变不会降低对ETR的敏感性，当与Y181C协同作用时，会降低ETR的敏感性。Y181C和V106A能导致EFV两倍耐药。
耐药的出现并非是全或无的，而是逐渐发展。HIV耐药的出现是不可避免的，随着耐药患者逐渐增多，治疗和管理耐药患者成为亟需解决的问题。加快开发和引进新药，并将其列入到国家免费抗病毒治疗行列中，能增加多重耐药的患者的生存率；加强HIV耐药监测和监控，扩大预防艾滋病的健康教育范围，对艾滋病患者及其家属进行正确的心理辅导，为抗病毒治疗失败病人选择新治疗方案，同时提高艾滋病人的服药依从性，尽最大努力遏制和减少耐药毒株的发生、发展和传播。
参考文献：
[1]中国疾病预防控制中心.2013年第一季度全国艾滋病性病疫情及主要防治工作进展[J].中国艾滋病性病，2013，19（5）：317.
[2]Hosseinipour MC，et al.The public health approach to identify antiretroviral therapy failure：high-level nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance among Malawians failing first-line antiretroviral therapy.AIDS，2009，23（9）：1127-1134.
[3]HIV drug resistance mutations[EB/OL].San Francisco：International AIDS Society-USA，2002.[2004-02-09].http：//www.iasusa.org/resistance_mutations/index.html.
[4]Svicher V，Alteri C，et al.Different evolution and patterns of genotypic resistance profiles in emtricitabine plus tenofovir and lamivudine plus tenofovir containing regimen[J].Antivir Ther 2009，14 Suppl 1：A251.
[5]Melnick JL，Adam E，DeBakey ME.Cytomegalovirus and atherosclerosis[J].Bioessays，1995，17（10）：899-903.
[6]Francois Clavel，and Allan J.Hance，HIV Drug Resistance[J].N Engl J Med，2004，350（10）：1023-1035.
[7]Hamers RL，Sigaloff KCE，Wensing AM，et al.Patterns of HIV-1 Drug resistence after first-line antiretroviral therapy（ART）failure in 6 sub-Saharan African countrier：implications for scend-line ART strategies.Clin Infect Dis，2012，54（11）：1660-1669.
[8]李文静，李航，等.哈尔滨市39例HIV-1毒株原发耐药的变异研究[J].中国病毒病杂志，2012，2（6）：40-45.
[9]Esnouf RM，Ren J，Hopkins AL，et al.Unique features in the structure of the complex between HIV-1 reverse transcriptase and the bis（heteroaryl）piperazine（BHAP）U-90152 explain resistance mutations for this nonnucleoside inhibitor[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（8）：3984- 3989.
[10]HIV Drug Resistance Database[DB].Stanford University：NNRTI Mutation Pattern & Susceptibility.
[11]Daniel R.Kuritzkes HIV Resistance：Frequency，Testing，Mechanisms，International AIDS Society-USA Topic in HIV Medicine[J].2007，15（15）：150-154.
[12]Reuman EC，Rhee SY，Holmes SP，et al.Constrained patterns of covariation and clustering of HIV-1 non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance mutation[J].Antrimicrob Chemother，2010，65（7）：1477-1485.
作者简介：
贾豫晨（1988-），女，云南大理人，硕士在读，研究方向：流行病与卫生统计。
关键词：艾滋病；HIV-1；耐药
大多数艾滋病患者在开始抗病毒治疗后的半年内，病毒载量已达到检测不到的水平。但是，还有部分患者的病毒载量依然处于较高的水平，这意味着抗病毒治疗失败。影响抗病毒治疗效果的因素很多，HIV-1病毒产生的耐药性就是一个主要的因素。HIV耐药毒株的产生和传播使得艾滋病治疗工作的可持续性面临严峻的挑战[1]。因此及时对艾滋病患者耐药情况进行分析，探讨基因突变对抗病毒治疗的影响，对艾滋病防治和监测具有重大意义。本次研究将对云南省艾滋病治疗失败患者耐药情况进行分析。
1 对象与方法
1.1 对象 从2011年云南省进行抗病毒治疗的HIV患者中筛选。入选标准：开展艾滋病抗病毒治疗半年以上，病毒载量≥1000copies/mL。
1.2 方法
1.2.1 从2011年云南省进行艾滋病抗病毒治疗六个月以上，病毒载≥1000copies/ml的患者中进行筛选，采集全血分离血浆进行Bayer VERSANTTM 440 Molecular System测定病毒载量，同时采集病人的流行病学信息，分析人口学及流行病学特征，美国ABI公司9700PCR扩增仪进行反转录套式聚合酶链反应（Reverse Transcription—Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）扩增，扩增产物送至北京博迈德公司测序，测序结果提交至美国斯坦福大学HIV耐药数据库（http：//hivdb.stanford.edu）分析耐药突变情况。
2 结果
2.1 样本流行病学资料分析：共获得280例流行病学资料完整的样本。280例艾滋病患者男女比例为1.72/1：年龄在19-72岁，平均年龄45岁；93.93%的患者抗病毒治疗时间在1年以上；传播途径以异性传播为主（54.29%），同性传播为男男同性性传播（1.07%），已婚或同居患者占多数（65.71%）；93.93%的患者抗病毒治疗时间在1年以上；药物治疗方案3TC+AZT+NVP为主（34.64%）。
2.2 耐药基因情况
2.2.1 PIs耐药突变结果：有13份存在蛋白酶抑制剂（PIs）耐药突变，突变率为4.64%（13/280）。PI相关突变位点有7个，分别为L33F（2.50%，7/280），V82A（1.07%，3/280），M46I和L76V均为2例（0.71%，2/280），V82F、N88D和I54V均为1例（0.36%，1/280）。
2.2.2 NNRTIs耐药突变结果：有166份存在核苷（酸）类反转录酶抑制剂（NRTIs）耐药突变，耐药突变率为59.29%（166/280）。NRTIs相关突变位点有21个，分别为M184V（51.07%，143/280），D67N（12.14%，34/280），K70R（10.71%，30/280），M41L（8.57%，24/280），T215Y（7.50%，21/280），T215F（7.14%，20/280），A62V（5.0%，14/280），K219E、K219Q和L210W均为11例（3.93%，11/280），V75I（2.86%，8/280），K65R（2.14%，6/280），M184I和V75M均为5例（1.79%，5/280），T69Ins（1.07%，3/280），Q151M和F116Y均为2例（0.71%，2/280），L74V、F77L、Y115F和L74I均为1例（0.36%，1/280）。
2.2.3 NRTIs耐药突变结果：有249份存在非核苷类反转录酶抑制剂（NNRTIs）耐药突变，耐药突变率为88.93%（249/280）。NNRTIs相关突变位点有19个，分别为K103N（34.64%，97/280），Y181C（24.64%，69/280），G190A（23.21%，65/280），V179D（13.93%，39/280），A98G（9.29%，26/280），K101E（7.5%，21/280），V106M和P225H均为17例（6.07%，7/280），V108I（5%，14/280），F227L（3.21%，9/280），V179E（2.86%，8/280），V106A和M230L均为7例（2.5%，7/280），G190S（2.14%，6/280），K103S和K238T均为4例（1.43%，4/280），Y188L（1.07%，3/280），K101P和Y188C均为2例（0.71%，2/280），Y188H（0.36%，1/280）。
2.3 对抗病毒药物的耐药情况
280例艾滋病患者中，有146例（52.14%）对NRTIs出现了不同程度的耐药，有220例（78.57%）对NNRTIs出现了不同程度的耐药，有10例（3.57%）对PIs出现了不同程度的耐药。280例艾滋病患者具体耐药情况。 3 讨论
3.1 一般情况分析：从传播途径来看，性传播是主要的传播途径（包括同性和异性传播，占56.27%），这可能是一些地州对不洁性行为危害的健康教育宣传力度还不够大。从年龄来看，50岁以上患者比例为11.43%，随着HAART的广泛应用，艾滋病患者的存活周期延长，这可能是导致中老年感染者增加的原因。
3.2 经过检测发现，PIs的耐药性突变较其他药物多，且作用机制十分复杂。此次研究发现蛋白酶区主要耐药突变位点为：M46I。M46I可导致ATV/r（阿扎那韦）的敏感性丧失，可引起除SQV/r以外的其他PIs类药物敏感性降低。引起PIs交叉耐药的主要突变位点是V82A/F和M46I。在接受IDV/r的患者中常出现V82A/F。M46I和I54V常出现在接受IDV/r和NFV治疗的患者中。因N88D对PIs极少有交叉耐药，所以NFV治疗后出现耐药的患者常对含另一个不同PIs的治疗方案敏感。在这次云南省2011年耐药基因的研究中发生PIs基因耐药位点突变的患者主要以次要耐药位点突变为主。体外研究表明，蛋白酶基因区次要突变单独或者联合出现都不能导致治疗的失败，只有与主要突变同时存在时，才能降低对药物的敏感性[2]。蛋白酶类药物的耐药率较低，可能是云南省蛋白酶类药物目前在抗病毒治疗中应用较少，还未对病毒形成足够大的药物选择压力。
最常见的NRTIs耐药性突变是M184V，因为治疗方案中几乎都使用了3TC，所以出现针对3TC的M184V突变率最高。研究发现，81%治疗失败的患者会发生M184V突变[3]。当3TC作为HAART方案中的一种药物时，M184V总是首先出现。M184V往往导致病人对3TC和FTC的高度耐药[4]，并能增加AZT、ddI以及TDF的敏感性[5]。检测结果显示HIV-1对FTC的耐药率为49.64%，而在用药方案中并无患者使用FTC，这是由于3TC作为治疗用药时，发生耐药突变时最早出现的耐药位点是M184V[6]，而M184V在导致3TC产生高度耐药的同时也会对FTC产生高度耐药。在含D4T和ddI方案治疗失败后常出现Q151M复合体。A62V、V75I和F116Y包括在Q151M耐药复合体中，它们对AZT、D4T和ABC产生的高度耐药[7]，对TDF、3TC和FTC产生中度耐药。
NNRTIs的耐药屏障很低，1至2个突变就可导致高度耐药。K103N、G190A和Y181C是3个非常重要的耐药突变位点。在耐药患者中，K103N发生率达8.5%[8-9]，且具有较高的复制能力和复制适应性[10]。研究显示，低频的K103N可用来预测治疗是否失败[11]。Y181C的单独突变即可引起NVP的高度耐药，且无耐药位点的积累。含NVP的治疗方案中常发生Y181C突变，而使用EFV方案的则相对较少出现Y181C突变[12]。V106A能导致NVP耐药性增加30倍。G190A/S单独突变不会降低对ETR的敏感性，当与Y181C协同作用时，会降低ETR的敏感性。Y181C和V106A能导致EFV两倍耐药。
耐药的出现并非是全或无的，而是逐渐发展。HIV耐药的出现是不可避免的，随着耐药患者逐渐增多，治疗和管理耐药患者成为亟需解决的问题。加快开发和引进新药，并将其列入到国家免费抗病毒治疗行列中，能增加多重耐药的患者的生存率；加强HIV耐药监测和监控，扩大预防艾滋病的健康教育范围，对艾滋病患者及其家属进行正确的心理辅导，为抗病毒治疗失败病人选择新治疗方案，同时提高艾滋病人的服药依从性，尽最大努力遏制和减少耐药毒株的发生、发展和传播。
参考文献：
[1]中国疾病预防控制中心.2013年第一季度全国艾滋病性病疫情及主要防治工作进展[J].中国艾滋病性病，2013，19（5）：317.
[2]Hosseinipour MC，et al.The public health approach to identify antiretroviral therapy failure：high-level nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance among Malawians failing first-line antiretroviral therapy.AIDS，2009，23（9）：1127-1134.
[3]HIV drug resistance mutations[EB/OL].San Francisco：International AIDS Society-USA，2002.[2004-02-09].http：//www.iasusa.org/resistance_mutations/index.html.
[4]Svicher V，Alteri C，et al.Different evolution and patterns of genotypic resistance profiles in emtricitabine plus tenofovir and lamivudine plus tenofovir containing regimen[J].Antivir Ther 2009，14 Suppl 1：A251.
[5]Melnick JL，Adam E，DeBakey ME.Cytomegalovirus and atherosclerosis[J].Bioessays，1995，17（10）：899-903.
[6]Francois Clavel，and Allan J.Hance，HIV Drug Resistance[J].N Engl J Med，2004，350（10）：1023-1035.
[7]Hamers RL，Sigaloff KCE，Wensing AM，et al.Patterns of HIV-1 Drug resistence after first-line antiretroviral therapy（ART）failure in 6 sub-Saharan African countrier：implications for scend-line ART strategies.Clin Infect Dis，2012，54（11）：1660-1669.
[8]李文静，李航，等.哈尔滨市39例HIV-1毒株原发耐药的变异研究[J].中国病毒病杂志，2012，2（6）：40-45.
[9]Esnouf RM，Ren J，Hopkins AL，et al.Unique features in the structure of the complex between HIV-1 reverse transcriptase and the bis（heteroaryl）piperazine（BHAP）U-90152 explain resistance mutations for this nonnucleoside inhibitor[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（8）：3984- 3989.
[10]HIV Drug Resistance Database[DB].Stanford University：NNRTI Mutation Pattern & Susceptibility.
[11]Daniel R.Kuritzkes HIV Resistance：Frequency，Testing，Mechanisms，International AIDS Society-USA Topic in HIV Medicine[J].2007，15（15）：150-154.
[12]Reuman EC，Rhee SY，Holmes SP，et al.Constrained patterns of covariation and clustering of HIV-1 non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance mutation[J].Antrimicrob Chemother，2010，65（7）：1477-1485.
作者简介：
贾豫晨（1988-），女，云南大理人，硕士在读，研究方向：流行病与卫生统计。