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【摘要】目的 获得大肠癌始动细胞转移相关基因表达变化谱，其细胞生物学特性研究提供依据。方法 采用无血清悬浮培养、CD133抗体标记磁珠分选Colo205不同细胞群，体外分化实验及裸鼠成瘤实验鉴定细胞特性，表达谱测序分析转移相关基因表达变化。结果：3种细胞群中有14种癌症转移相关基因发生显著地表达改变。 结论：无血清培养基培养结合CD133磁珠分选Colo205细胞获得的CD133+细胞亚群具备大肠癌干细胞的基本特征且有14种转移相关基因表达发生显著改变，可用于后续生物学特性研究。
【关键词】始动细胞;大肠癌;表达谱测序;转移基因
Abstract： Objective To obtain differential genes for research of colorectal cancer initiating cells biological behavior. Methods Initiating cells were sorted by by CD133 microbead kit and RNA-seq was employed for analysis of differential genes. Results Expression levels of 14 metastatic genes were changed on the levels of mRNA. Conclusion Colorectal cancer initiating cells were obtained and expression of 14 metastatic genes has been changed on the level of mRNA.
Keywords： Colorectal cancer; initiating cell; metastatic genes; RNA-seq.
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）011- 0001-02
大肠癌（colorectal cancer）是目前国内发病率次仅于肺癌、乳腺癌的严重危害人类健康的恶性肿瘤，近年来结肠癌的发病率呈逐年上升趋势[1，2]。一般认为大肠癌发病机制与环境、遗传、大肠腺瘤以及慢性大肠炎症有关的涉及多个癌基因激活和抑癌基因失活渐变过程[3，4]。 肿瘤干细胞理论认为癌症难以治愈的一个重要原因是肿瘤中具有干细胞（Stem Cell）性质的癌细胞即肿瘤始动细胞（Cancer initiating cell）的存在 [5]。 大肠癌干细胞是消化道恶性肿瘤中第一个被发现的癌症始动细胞，分选并鉴定不同来源的肠癌始动细胞对于其后续的生物学特性分析、大肠癌诊断及综合防治措施的制定等具有极为重要的意义[6]。本研究通过CD133+
标记的免疫磁珠分选大肠癌始动细胞，利用体外分化实验和裸鼠成瘤实验对分选的大肠癌始动细胞的干细胞特性进行鉴定和验证，并用RNA-seq研究了肠癌转移基因表达变化，共有14个大肠癌转移相关的基因的表达水平发生改变。可为肿瘤分类与分型的基因标记物以及药物治疗潜在靶点的发现，深入理解大肠癌肿瘤的发生机制，以及大肠癌的临床治疗提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1细胞株与动物 人大肠癌colo205细胞株购于中国科学院上海生命科学院细胞库; 4周龄BABL/ c雄裸鼠购自第三军医大学大坪医院动物中心，9只，体重20-25g，饲养于遵义医学院医学与生物研究中心SPF动物饲养房。
1.1.2 主要试剂TRIzol?、 B27添加剂（B27）及实验所需生长因子购自Invitrogen公司;二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶粉购自Sigma公司;培养基及血清购自Gibco公司; CD 133细胞分选试剂盒 （CDl33 Cell Isolation Kit） 购自Miltenyi公司。常规细胞培养等无酶耗材均购自杭州爱思进公司。无血清培养基（serum free medium，SFM）为本实验新鲜配制（98ml DMEM/F12培养基含2.0ml B27，0.2μg bFGF， 0.2μg LIF，0.2μg EGF， 加超纯水定容到100ml，过滤灭菌，- 20℃保存，备用）。表达谱测序全套试剂购自Illumina公司。
1.2 方法
1.2.1 Colo205始动细胞分选 取对数增长期Colo205细胞，以105/ mL的细胞密度接种至SFM中培养;每2～ 3d加入2ml SFM培养基换液;10d后用酶消化法及机械分离法将colo205干细胞球分离成单细胞悬液后传代。将形态稳定的colo205干细胞单细胞悬液加入100μl FcR blocking及100μl CD133免疫磁珠， 4℃孵化30min;分选 Buffer洗涤细胞，800rpm、离心10min，弃上清。分选Buffer重悬细胞，将细胞悬液过柱，收集CD133-细胞，用500μl分选 和CD133+阳性细胞。
1.2.2体外分化及裸鼠成瘤试验
将分选所得CD133+与CD133-细胞密度调整至105/ml接种SFM培养，每2-3天加入2ml SFM培养基。10d天后向SFM中加入胎牛血清（SFM与胎牛血清的体积比为9：1），继续培养。将分选得到CD133+、CD133-细胞及未分选的colo205细胞分别用生理盐水稀释，以1×103、1×104、1×105细胞数量分别将CD133+、CD133-细胞及未分选的colo205细胞接种至同一只babl/ c裸鼠左右腋下和右侧腹股沟后饲养于SPF级动物房，观察肿瘤生长情况并拍照。 1.2.3 RNA-seq及生物学信息学分析
用TRIzol?总RNA提取试剂盒提取5g以上的总RNA（OD260/OD280≈1.9～2.0），利用Dynabeads? mRNA试剂盒利用磁珠法分离纯化mRNA后样品委托上海美吉生物技术公司进行高通量测序文库的构建及数据处理。CD133+组/Colo205组/CD133-等3组样品间两两样品的转录本的表达量变化差异显著，以P<0.05和q<0.05和表达变化差异为-2和2倍为差异表达基因筛选标准。
1.2.4 差异基因定量PCR验证 为了进一步验证表达谱测序获得基因表达变化数据的可靠性，我们随机选取了p53和BCL11A基因，并以?-actin基因作为内参，进行表达变化的定量PCR验证。P53F，5-′ CCCTCCTCAGCATCTTATCCG-3′; P53R， 5-′CAACCT CAGGCGGCTCATAG-3′;BCL11AF 5-′GACAGGGTGCTGCGGT TGA -3′，BCL11AR 5-′ GGCTTGCTACCTGGCTGGAA -3′;?-actin 引物：?-actin F 5-′ TGGCACCCAGCCAATGAA-3′， ?-actin R 5-′ CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。定量PCR反应条件为：95℃ 预变性2mim，40个热循环扩增（95℃变性 10s ， 60℃ 退火扩增 20s），获得Ct值，以2-△△Ct法进行表达变化分析。
2. 结果与分析
2.1 大肠癌始动细胞体外分化及成瘤能力 大肠癌Colo205细胞SFM培养基培养1d内可见大部分细胞贴壁，随传代次数增多，细胞团趋于球型。CD133+细胞培养1d后，细胞成团并悬浮生长，4d可见典型肿瘤细胞球出现，加入胎牛血清， CDl33+细胞形态与之前在SSM培养基中的Colo205 细胞相同（图1. D），CDl33-细胞则始终未见肿瘤细胞球生成。
不同细胞群细胞接种裸鼠，S第15天见105个CD133+细胞接种处开始见肿瘤生长，瘤体迅速增大;第20天104个CD133+细胞接种处见肿瘤生长;接种第30天103个CD133+细胞接种处见肿瘤生长;接种第35天105个colo205细胞接种处见肿瘤生长;第40天104个和103个colo205细胞及CD133-细胞接种处未见肿瘤生长。到42天观察期结束，仅需接种103个CD133+细胞就可以在裸鼠皮下形成肿瘤，所有CD133+细胞接种处均成瘤;而colo205细胞需接种105个才能在第35天形成肿瘤，共有2只裸鼠成瘤;所有CD133-细胞接种处均未见肿瘤生长（图2）。CD133+细胞内成瘤能力强于CD133-细胞及colo205细胞，有明显差异，P<0.05;而CD133-及colo205细胞间成瘤能力无明显差异。
2.2 大肠癌Colo205来源细胞群转移相关基因表达变化
依据所有样本与参考基因组比对的结果，以FDR<0.05为显著差异基因/转录本筛选条件，利用分析软件Tophat及Cuffdiff分别转录本测序常规数据分析结果表明本次测序所有样品的FPKM分布差异不显著。
将Illumina平台测得CD133+、CD133-与未分选细胞基因序列与人参考基因对比后分别得到12915738、16118258及19304605条序列。依据这些序列计算每个基因在三种细胞中的FPKM值，以该值作为基因在该细胞中的表达量，3种细胞癌症转移相关基因的表达进行差异显著性分析发现：CD133+细胞与未分选的colo205细胞相比，有9个基因表达明显上调，3个基因表达明显下调，2个基因表达变化不大;CD133-细胞与未分选的colo205细胞比较的有10个基因表达明显上调，4个基因表达明显下调。CD133+细胞较CD133-细胞差异表达基因中有2个基因表达明显上调，个基因表达明显下调，10个基因表达变化不大。
3. 讨论
磁珠分选肿瘤干细胞最重要的是确定肿瘤干细胞的表面标志物，目前运用于大肠癌干细胞的标志物有CDl33、CDl66[16]、CD44[17]等。其中CDl33最具有争议性。比如O’Brien [5]等研究显示：在大肠癌细胞中成瘤的细胞均为CD133+，但不是所有的CD133+细胞都可能导致肿瘤的生成，由此认为不是所有的CD133+细胞都是大肠癌干细胞。虽然目前对CD133做为大肠癌的表面标志物，必须结合细胞亚群做成瘤性鉴定[5-11]，如成瘤能力强的细胞亚群能够能在无血清培养基中成球生长并增殖，且形成的肿瘤细胞球能在血清诱导下则贴壁分化，并能在在裸鼠体内形成肿瘤[12-17]。
为了筛选与大肠癌诊断密切且相关的基因，本研究对裸鼠成立验证的磁珠筛选的colo205来源的不同细胞群进行表达谱测序分析，并利用定量PCR技术对随机选取的两个锌指蛋白表达进行验证，结果这两个基因的表达变化趋势与表达谱测序结果一致（如基因p53 在CD133+/ CDl33-分别为2.366和1.61，在colo205/ CDl33-分别为2.17和1.6;基因BCL11A在CD133+/ CDl33-分别为2.951067和2.25012，在CD133+/colo205分别为0.149702和0.25174）。
本文用无血清培养基悬浮培养法联合CD133磁珠分选法能获得不同Colo205来源细胞群经过裸鼠成瘤实验及体外分化实验鉴定表明CD133+细胞具大肠癌干细胞自我更新、分化及裸鼠成瘤特性，说明无血清培养法联合磁珠分选法是分离、纯化大肠癌始动细胞是一种行之有效的方法。我们用RNA-seq研究了肠癌转移基因表达变化，共有14个大肠癌转移相关的基因的表达水平发生改变，可为肿瘤分类与分型的基因标记物以及药物治疗潜在靶点的发现，深入理解大肠癌肿瘤的发生机制，以及大肠癌的临床治疗提供依据。 参考文献：
[1] 池桂林，许岸高 大肠癌早期诊断的研究进展.[J]. 医学综述，2008，14（19） ： 2937-2939
[2] 黄文生，陈柳静.肿瘤干细胞与结直肠癌肿瘤干细胞. [J]. 医学综述，2007，13： 194-196.
[3] Pierce GB.Teratocarcinoma：model for a developmental concept of cancer .[J].Curr Top Dev Biol， 1967，2（2）：223-246
[4] Fuch E，Tumbar T，and Guasch G. Socializing with the neighbors：stem cells and their niche. [J].Cell， 2004， 11 6（6）：769-778.
[5] O’Brien，Pollett A，Gallinger and Dick JE. A human colon cancer cell Capable of initiating tumour growth inimmuno-deficient mice.[J].Nature， 2007， 445（7123）：106-110.
[6] Martens D J， Tropepe V， vander Kooy D. Prolieration kinetics of fibroblast growth factor responsive and epidermal growth factor responsive neural stem cells with in the embryonic forebrain germ inalzone.[J]. J Neuro sci， 2000， 20（3）： 1085-1095.
[7] Wright S， Li J， Caldwell M A， et al. Gene expressioninn human neural stem cells：effects of leukemia inhibitory factor.[J]. J Neurochem， 2003， 86（1）： 179-195.
[8] Dontu G， Jackson KW， McNicholas E， et al. Role of notch signaling in cell-fate determination of human mammary stem/ progenitor cells.[J]. Breast Cancer Res， 2004， 6（6）： 1-11.
[9] Farnie G， Clarke RB. Mammary stem cells and breast cancer--role of notch signaling.[J].Stem Cell Rev， 2007， 3（2）： 169-175.
[10] Sung JM， Cho HJ， Yi H， et al. Characterization of a stem cell population in lung cancer A549 cells.[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2008， 371（1）： 163-167.
[11] Bonnet D， Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. [J]. Nat Med， 1997， 3（7）： 730-737.
[12] 项芳芳， 毛高平. 大肠癌与抑癌基因相关性的研究现状.[J]. 世界华人消化杂志，2012，20（5）： 394-398
[13] 周东，陈嘉勇. 大肠癌基因治疗研究进展.[J]. 医学综述，2011，17（17）：2611-2613.
[14] 周莹，朱莹杰. 大肠癌疗效及预后相关基因研究进展.[J]. 肿瘤学杂志，2013， 19（4）：302-306.
[15] 董平 ，袁建保 . 胃肠肿瘤标志物诊断大肠癌之检验医学实践.[J].中外医学研究，，2013，33：145-146.
[16] O’Brien，Pollett A，Gallinger and Dick JE. A human colon cancer cell Capable of initiating tumour growth inimmuno- deficient mice.[J].Nature， 2007， 445（7123）：106-110.
[17] Shmelkov SV，Butler JM， Hooper AT， et al. CD133 expression is not restricted to stem cells，and both CD133+and CD133-metastatic colon cancer cells initiate tumors.[J] Clin Invest， 2008， 118：2111-2120.
【关键词】始动细胞;大肠癌;表达谱测序;转移基因
Abstract： Objective To obtain differential genes for research of colorectal cancer initiating cells biological behavior. Methods Initiating cells were sorted by by CD133 microbead kit and RNA-seq was employed for analysis of differential genes. Results Expression levels of 14 metastatic genes were changed on the levels of mRNA. Conclusion Colorectal cancer initiating cells were obtained and expression of 14 metastatic genes has been changed on the level of mRNA.
Keywords： Colorectal cancer; initiating cell; metastatic genes; RNA-seq.
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）011- 0001-02
大肠癌（colorectal cancer）是目前国内发病率次仅于肺癌、乳腺癌的严重危害人类健康的恶性肿瘤，近年来结肠癌的发病率呈逐年上升趋势[1，2]。一般认为大肠癌发病机制与环境、遗传、大肠腺瘤以及慢性大肠炎症有关的涉及多个癌基因激活和抑癌基因失活渐变过程[3，4]。 肿瘤干细胞理论认为癌症难以治愈的一个重要原因是肿瘤中具有干细胞（Stem Cell）性质的癌细胞即肿瘤始动细胞（Cancer initiating cell）的存在 [5]。 大肠癌干细胞是消化道恶性肿瘤中第一个被发现的癌症始动细胞，分选并鉴定不同来源的肠癌始动细胞对于其后续的生物学特性分析、大肠癌诊断及综合防治措施的制定等具有极为重要的意义[6]。本研究通过CD133+
标记的免疫磁珠分选大肠癌始动细胞，利用体外分化实验和裸鼠成瘤实验对分选的大肠癌始动细胞的干细胞特性进行鉴定和验证，并用RNA-seq研究了肠癌转移基因表达变化，共有14个大肠癌转移相关的基因的表达水平发生改变。可为肿瘤分类与分型的基因标记物以及药物治疗潜在靶点的发现，深入理解大肠癌肿瘤的发生机制，以及大肠癌的临床治疗提供依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1细胞株与动物 人大肠癌colo205细胞株购于中国科学院上海生命科学院细胞库; 4周龄BABL/ c雄裸鼠购自第三军医大学大坪医院动物中心，9只，体重20-25g，饲养于遵义医学院医学与生物研究中心SPF动物饲养房。
1.1.2 主要试剂TRIzol?、 B27添加剂（B27）及实验所需生长因子购自Invitrogen公司;二甲基亚砜（DMSO）、胰蛋白酶粉购自Sigma公司;培养基及血清购自Gibco公司; CD 133细胞分选试剂盒 （CDl33 Cell Isolation Kit） 购自Miltenyi公司。常规细胞培养等无酶耗材均购自杭州爱思进公司。无血清培养基（serum free medium，SFM）为本实验新鲜配制（98ml DMEM/F12培养基含2.0ml B27，0.2μg bFGF， 0.2μg LIF，0.2μg EGF， 加超纯水定容到100ml，过滤灭菌，- 20℃保存，备用）。表达谱测序全套试剂购自Illumina公司。
1.2 方法
1.2.1 Colo205始动细胞分选 取对数增长期Colo205细胞，以105/ mL的细胞密度接种至SFM中培养;每2～ 3d加入2ml SFM培养基换液;10d后用酶消化法及机械分离法将colo205干细胞球分离成单细胞悬液后传代。将形态稳定的colo205干细胞单细胞悬液加入100μl FcR blocking及100μl CD133免疫磁珠， 4℃孵化30min;分选 Buffer洗涤细胞，800rpm、离心10min，弃上清。分选Buffer重悬细胞，将细胞悬液过柱，收集CD133-细胞，用500μl分选 和CD133+阳性细胞。
1.2.2体外分化及裸鼠成瘤试验
将分选所得CD133+与CD133-细胞密度调整至105/ml接种SFM培养，每2-3天加入2ml SFM培养基。10d天后向SFM中加入胎牛血清（SFM与胎牛血清的体积比为9：1），继续培养。将分选得到CD133+、CD133-细胞及未分选的colo205细胞分别用生理盐水稀释，以1×103、1×104、1×105细胞数量分别将CD133+、CD133-细胞及未分选的colo205细胞接种至同一只babl/ c裸鼠左右腋下和右侧腹股沟后饲养于SPF级动物房，观察肿瘤生长情况并拍照。 1.2.3 RNA-seq及生物学信息学分析
用TRIzol?总RNA提取试剂盒提取5g以上的总RNA（OD260/OD280≈1.9～2.0），利用Dynabeads? mRNA试剂盒利用磁珠法分离纯化mRNA后样品委托上海美吉生物技术公司进行高通量测序文库的构建及数据处理。CD133+组/Colo205组/CD133-等3组样品间两两样品的转录本的表达量变化差异显著，以P<0.05和q<0.05和表达变化差异为-2和2倍为差异表达基因筛选标准。
1.2.4 差异基因定量PCR验证 为了进一步验证表达谱测序获得基因表达变化数据的可靠性，我们随机选取了p53和BCL11A基因，并以?-actin基因作为内参，进行表达变化的定量PCR验证。P53F，5-′ CCCTCCTCAGCATCTTATCCG-3′; P53R， 5-′CAACCT CAGGCGGCTCATAG-3′;BCL11AF 5-′GACAGGGTGCTGCGGT TGA -3′，BCL11AR 5-′ GGCTTGCTACCTGGCTGGAA -3′;?-actin 引物：?-actin F 5-′ TGGCACCCAGCCAATGAA-3′， ?-actin R 5-′ CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。定量PCR反应条件为：95℃ 预变性2mim，40个热循环扩增（95℃变性 10s ， 60℃ 退火扩增 20s），获得Ct值，以2-△△Ct法进行表达变化分析。
2. 结果与分析
2.1 大肠癌始动细胞体外分化及成瘤能力 大肠癌Colo205细胞SFM培养基培养1d内可见大部分细胞贴壁，随传代次数增多，细胞团趋于球型。CD133+细胞培养1d后，细胞成团并悬浮生长，4d可见典型肿瘤细胞球出现，加入胎牛血清， CDl33+细胞形态与之前在SSM培养基中的Colo205 细胞相同（图1. D），CDl33-细胞则始终未见肿瘤细胞球生成。
不同细胞群细胞接种裸鼠，S第15天见105个CD133+细胞接种处开始见肿瘤生长，瘤体迅速增大;第20天104个CD133+细胞接种处见肿瘤生长;接种第30天103个CD133+细胞接种处见肿瘤生长;接种第35天105个colo205细胞接种处见肿瘤生长;第40天104个和103个colo205细胞及CD133-细胞接种处未见肿瘤生长。到42天观察期结束，仅需接种103个CD133+细胞就可以在裸鼠皮下形成肿瘤，所有CD133+细胞接种处均成瘤;而colo205细胞需接种105个才能在第35天形成肿瘤，共有2只裸鼠成瘤;所有CD133-细胞接种处均未见肿瘤生长（图2）。CD133+细胞内成瘤能力强于CD133-细胞及colo205细胞，有明显差异，P<0.05;而CD133-及colo205细胞间成瘤能力无明显差异。
2.2 大肠癌Colo205来源细胞群转移相关基因表达变化
依据所有样本与参考基因组比对的结果，以FDR<0.05为显著差异基因/转录本筛选条件，利用分析软件Tophat及Cuffdiff分别转录本测序常规数据分析结果表明本次测序所有样品的FPKM分布差异不显著。
将Illumina平台测得CD133+、CD133-与未分选细胞基因序列与人参考基因对比后分别得到12915738、16118258及19304605条序列。依据这些序列计算每个基因在三种细胞中的FPKM值，以该值作为基因在该细胞中的表达量，3种细胞癌症转移相关基因的表达进行差异显著性分析发现：CD133+细胞与未分选的colo205细胞相比，有9个基因表达明显上调，3个基因表达明显下调，2个基因表达变化不大;CD133-细胞与未分选的colo205细胞比较的有10个基因表达明显上调，4个基因表达明显下调。CD133+细胞较CD133-细胞差异表达基因中有2个基因表达明显上调，个基因表达明显下调，10个基因表达变化不大。
3. 讨论
磁珠分选肿瘤干细胞最重要的是确定肿瘤干细胞的表面标志物，目前运用于大肠癌干细胞的标志物有CDl33、CDl66[16]、CD44[17]等。其中CDl33最具有争议性。比如O’Brien [5]等研究显示：在大肠癌细胞中成瘤的细胞均为CD133+，但不是所有的CD133+细胞都可能导致肿瘤的生成，由此认为不是所有的CD133+细胞都是大肠癌干细胞。虽然目前对CD133做为大肠癌的表面标志物，必须结合细胞亚群做成瘤性鉴定[5-11]，如成瘤能力强的细胞亚群能够能在无血清培养基中成球生长并增殖，且形成的肿瘤细胞球能在血清诱导下则贴壁分化，并能在在裸鼠体内形成肿瘤[12-17]。
为了筛选与大肠癌诊断密切且相关的基因，本研究对裸鼠成立验证的磁珠筛选的colo205来源的不同细胞群进行表达谱测序分析，并利用定量PCR技术对随机选取的两个锌指蛋白表达进行验证，结果这两个基因的表达变化趋势与表达谱测序结果一致（如基因p53 在CD133+/ CDl33-分别为2.366和1.61，在colo205/ CDl33-分别为2.17和1.6;基因BCL11A在CD133+/ CDl33-分别为2.951067和2.25012，在CD133+/colo205分别为0.149702和0.25174）。
本文用无血清培养基悬浮培养法联合CD133磁珠分选法能获得不同Colo205来源细胞群经过裸鼠成瘤实验及体外分化实验鉴定表明CD133+细胞具大肠癌干细胞自我更新、分化及裸鼠成瘤特性，说明无血清培养法联合磁珠分选法是分离、纯化大肠癌始动细胞是一种行之有效的方法。我们用RNA-seq研究了肠癌转移基因表达变化，共有14个大肠癌转移相关的基因的表达水平发生改变，可为肿瘤分类与分型的基因标记物以及药物治疗潜在靶点的发现，深入理解大肠癌肿瘤的发生机制，以及大肠癌的临床治疗提供依据。 参考文献：
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[17] Shmelkov SV，Butler JM， Hooper AT， et al. CD133 expression is not restricted to stem cells，and both CD133+and CD133-metastatic colon cancer cells initiate tumors.[J] Clin Invest， 2008， 118：2111-2120.