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【摘要】目的：建立以核苷酸为原料保健食品中核苷酸含量测定的方法。方法：采用定磷法[1] [2]测定以核苷酸为保健食品原料的保健食品中核苷酸的含量测定。结果：核苷酸在2.5ug～15?g/ml范围内线性关系良好，r≥0.9995;回收率结果在98.6%-101.9%，RSD为1.29%（n=9）;。结论：定磷法简单、灵敏、快速、准确，适用于以核苷酸为原料保健食品中核苷酸含量测定的方法。
【关键词】核苷酸 保健食品 定磷法
Abstract：Objective：To establish a method to determine the total content of nucleotide contained in health food made with nucleotide as raw material.Methods：Total content of nucleotide contained in the health food were determined by Phosphorus determination method. Results： The content of nucleotide showed good linear relationship over the range of 2.5-15?g/ml （r=0.9999）.The recovery was 98.6-101.9% with RSD being 1.29%（n=9）.Conclusion：The phosphorus determination method is simple，sensitive，rapid，accurate and suitable for total content determination of nucleotide in health food made with nucleotide as raw material.
Keywords：nucleotide;Health food;Phosphorus determination method
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）011- 0011-03
核苷酸是核苷与磷酸通过磷酸酯键结合构成，糖环上的所有游离羟基（核糖的C-2、C-3、C-5）均能与磷酸发生酯化结合。生物体内核苷酸多是5’-核苷酸;此外细胞中存在具有重要代谢功能的多磷酸核苷酸。用于保健食品原料中的核苷酸为单磷酸核苷酸。
目前，国内外的核苷酸检测方法主要有高效液相色谱法、紫外法、定磷法、毛细管电泳法。美国食品化学品法典：FCC8中收录的核苷酸的检测方法，其中CMP、UMP、AMP用高效液相方法，而GMP、IMP用紫外方法。国家轻工行业标准核苷酸检测GMP采用紫外法，因此针对不同的核苷酸应该用不同的检测方法。
核苷酸为含有机磷[2]化合物，用浓硫酸将核苷酸中的磷转变为无机磷，在酸性条件下与定磷试剂反应生成磷钼酸铵，用还原剂还原成深蓝色钼蓝，在660nm[1]波长处测定其吸收值，用标准曲线法得有机磷含量，计算得核苷酸的含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器
DZKW电热恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂）;HM-200分析天平（万分之一）（日本AND公司）;AG135分析天平（十万分之一）（METTLER TOLEDO）;UV-2450紫外分光光度计（SHIMADZU）;TU-1901紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）;SP-1900UV紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）;Agilent 1260液相色谱仪-泵（安捷伦）;Agilent 1260DAD检测器（安捷伦）;Agilent B.04.02化学工作站（安捷伦）。
1.2 试剂
钼酸铵（分析纯）（批号：20100518，天津市化学试剂四厂（凯达化工厂））;抗坏血酸（分析纯）（批号：20130307，天津市科密欧化学试剂有限公司）;硫酸（分析纯）（批号：20111109，丹东市龙海试剂厂）硫酸二氢钾（分析纯）（批号：20130830，天津市大茂化学试剂厂）;硫酸铜（分析纯）（批号：20120206，天津市科密欧化学试剂有限公司）;硫酸钾（分析纯）（批号：20100701，天津市科密欧化学试剂有限公司）;过氧化氢（分析纯）（批号：20120227，天津市科密欧化学试剂有限公司）;甲醇（色谱纯）（批号：1627507209，Merck KGaA）;磷酸（分析纯）（批号：20110218，沈阳市联邦试剂厂）。
1.3 保健食品
珍奥?核诺胶囊（珍奥集团股份有限公司，批号：20130302）
2 方法
2.1 磷标准曲线的制备
取标准磷溶液（5μg/mL）0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，用水补足到3.0mL，含磷量分别为0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μg，加定磷试剂3.0mL后摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），以含磷量为横坐标，以A660为纵坐标绘制标准曲线。
2.2 供试品中总磷量的测定
2.2.1 精密称取（或量取）供试品适量（约含2.5-5mg核苷酸），置于消化瓶中，加入浓硫酸10mL及催化剂50mg，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑色变成淡黄色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至溶液呈无色至淡蓝色为止，冷至室温，用纯化水稀释到50mL，与样品消化的同时做空白对照，空白瓶中不加样品，用水代替，其他完全相同。（根据供试品含量可适当调整取样量及消化方式，最终制成约含核苷酸100μg/ml的消化液） 2.2.2 取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660）。空白对照同样操作。
2.3 供试品中无机磷含量测定
另取供试品适量，用水稀释到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660）。
2.4 结果计算
首先制作标准磷曲线，以5.2项中消化和5.3项中未消化的供试品溶液测得的A660 从标准曲线上查出总磷和无机磷的量，按式计算供试品中核苷酸的含量：
3 结果
3.1 线性和范围
3.1.1测定方法：取标准磷溶液（5μg/mL）0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5， 3.0mL，用水补足到
3.0mL，含磷量分别为0，2.5，5.0，7.5，10，12.5，15.0μg，加定磷试剂3.0mL后摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸光度（A660），0点为空白，以含磷量（μg） 为横坐标，以吸光度值（A660）为纵坐标绘制标准曲线。
3.1.2 标准曲线绘制：
标准曲线
3.1.3 单项结论：标准曲线为Y=0.04998X+0.00382，相关系数r=0.9999。
3.2 精密度
3.2.1 重复性
3.2.1.1对照测定：精密吸取6组标准磷溶液（5μg/mL）各1.0mL用水补足到3.0mL，加定磷试剂3.0mL后摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸光度（A660）。结果见表2。
3.2.1.2 供试品的测定：供试品为珍奥核诺胶囊（批号：20130302，理论含量：33.6%）;称取供试品15mg，置于消化瓶中，加入10mL浓硫酸及50mg催化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑色变成淡黄色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至溶液呈无色至淡蓝色为止，冷至室温，用纯化水定容到50mL，与样品消化的同时做空白对照，空白瓶中不加样品，用水代替，其他完全相同。取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），空白对照同样操作，测定总磷含量;另取供试品15mg，用水定容到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），测定无机磷含量，根据公式计算出供试品核苷酸的含量。结果见表3
3.2.1.3 单项结论：以上测定结果的RSD值分别为0.40%、0.49%.
3.2.2中间精密度
3.2.2.1 供试品的测定：3名分析人员用不同仪器对供试品进行测定，供试品为珍奥核诺胶囊（批号：20130302，理论含量：33.6%）;称取供试品15mg，置于消化瓶中，加入10mL浓硫酸及50mg催化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑色变成淡黄色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至溶液呈无色至淡蓝色为止，冷至室温，用纯化水定容到50mL，与样品消化的同时做空白对照，空白瓶中不加样品，用水代替，其他完全相同。取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），空白对照同样操作，测定总磷含量;另取供试品15mg，用水定容到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），测定无机磷含量，根据公式计算出供试品核苷酸的含量。结果见表4
3.2.2.2 标准曲线：
（1）Y=0.04899X+0.00260 相关系数r为0.9997
（2）Y=0.05017X-0.00140 相关系数r为0.9998
（3）Y=0.05073X-0.00854 相关系数r为0.9999
3.2.2.3 实验结果
3.2.2.4 单项结论：测定结果的RSD值为0.40%。
3.3 准确度
3.3.1加样回收率：精密称取9份供试品各15mg，分为低、中、高3组，每组3个样品，分别往各组供试品中加入含400μg、500μg、600μg的标准磷储备液置于消化瓶中，加入10mL浓硫酸及50mg催化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑色变成淡黄色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至溶液呈无色至淡蓝色为止，冷至室温，用纯化水定容到100mL，与样品消化的同时做空白对照，空白瓶中不加样品，用水代替，其他完全相同。取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），空白对照同样操作，测定总磷含量;另取供试品15mg，用水定容到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），测定无机磷含量，根据公式计算出供试品核苷酸的含量。结果见表4（供试品磷含量μg=15mg×33.45%×1000÷11÷100）
3.3.2 单项结论：回收率结果在98.6%-101.9%，RSD=1.29%
3.4 对比实验
3.4.1 方法
方法一：保健食品中核苷酸的测定方法（2003）;
方法二：本方法（定磷法）。
3.4.2 对比结果
3.4.2.1 供试品
供试品：珍奥核诺胶囊（批号：20130302），理论含量：33.6%。
3.4.2.2 实验数据
4 讨论
试验结果证明所建立的定磷法简单、灵敏、快速、准确，适用于以核苷酸为原料保健食品中核苷酸含量测定的方法。但由于本方法通过测定有机磷来推算核苷酸的含量，因此当配方中含其他有机磷化合物时，本方法不适用，存在局限性。
参考文献：
[1] 抗坏血酸一钼蓝显色定磷法检测转移因子制剂中核苷酸的含量， 宋红波，黑龙江医药Heilongjiang Medicine Journal Vo1.22 No.2 2009;
[2] 分光光度法测定有机磷的研究，王春林，广州化学;
[3] 寡核苷酸类药物磷的定性定量分析，李保山，CHINA MEDICINE AND PHARMACY，2013年4月第3卷第8。
【关键词】核苷酸 保健食品 定磷法
Abstract：Objective：To establish a method to determine the total content of nucleotide contained in health food made with nucleotide as raw material.Methods：Total content of nucleotide contained in the health food were determined by Phosphorus determination method. Results： The content of nucleotide showed good linear relationship over the range of 2.5-15?g/ml （r=0.9999）.The recovery was 98.6-101.9% with RSD being 1.29%（n=9）.Conclusion：The phosphorus determination method is simple，sensitive，rapid，accurate and suitable for total content determination of nucleotide in health food made with nucleotide as raw material.
Keywords：nucleotide;Health food;Phosphorus determination method
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2014）011- 0011-03
核苷酸是核苷与磷酸通过磷酸酯键结合构成，糖环上的所有游离羟基（核糖的C-2、C-3、C-5）均能与磷酸发生酯化结合。生物体内核苷酸多是5’-核苷酸;此外细胞中存在具有重要代谢功能的多磷酸核苷酸。用于保健食品原料中的核苷酸为单磷酸核苷酸。
目前，国内外的核苷酸检测方法主要有高效液相色谱法、紫外法、定磷法、毛细管电泳法。美国食品化学品法典：FCC8中收录的核苷酸的检测方法，其中CMP、UMP、AMP用高效液相方法，而GMP、IMP用紫外方法。国家轻工行业标准核苷酸检测GMP采用紫外法，因此针对不同的核苷酸应该用不同的检测方法。
核苷酸为含有机磷[2]化合物，用浓硫酸将核苷酸中的磷转变为无机磷，在酸性条件下与定磷试剂反应生成磷钼酸铵，用还原剂还原成深蓝色钼蓝，在660nm[1]波长处测定其吸收值，用标准曲线法得有机磷含量，计算得核苷酸的含量。
1 仪器与试药
1.1 仪器
DZKW电热恒温水浴锅（北京永光明医疗仪器厂）;HM-200分析天平（万分之一）（日本AND公司）;AG135分析天平（十万分之一）（METTLER TOLEDO）;UV-2450紫外分光光度计（SHIMADZU）;TU-1901紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）;SP-1900UV紫外分光光度计（上海光谱仪器有限公司）;Agilent 1260液相色谱仪-泵（安捷伦）;Agilent 1260DAD检测器（安捷伦）;Agilent B.04.02化学工作站（安捷伦）。
1.2 试剂
钼酸铵（分析纯）（批号：20100518，天津市化学试剂四厂（凯达化工厂））;抗坏血酸（分析纯）（批号：20130307，天津市科密欧化学试剂有限公司）;硫酸（分析纯）（批号：20111109，丹东市龙海试剂厂）硫酸二氢钾（分析纯）（批号：20130830，天津市大茂化学试剂厂）;硫酸铜（分析纯）（批号：20120206，天津市科密欧化学试剂有限公司）;硫酸钾（分析纯）（批号：20100701，天津市科密欧化学试剂有限公司）;过氧化氢（分析纯）（批号：20120227，天津市科密欧化学试剂有限公司）;甲醇（色谱纯）（批号：1627507209，Merck KGaA）;磷酸（分析纯）（批号：20110218，沈阳市联邦试剂厂）。
1.3 保健食品
珍奥?核诺胶囊（珍奥集团股份有限公司，批号：20130302）
2 方法
2.1 磷标准曲线的制备
取标准磷溶液（5μg/mL）0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，用水补足到3.0mL，含磷量分别为0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μg，加定磷试剂3.0mL后摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），以含磷量为横坐标，以A660为纵坐标绘制标准曲线。
2.2 供试品中总磷量的测定
2.2.1 精密称取（或量取）供试品适量（约含2.5-5mg核苷酸），置于消化瓶中，加入浓硫酸10mL及催化剂50mg，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑色变成淡黄色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至溶液呈无色至淡蓝色为止，冷至室温，用纯化水稀释到50mL，与样品消化的同时做空白对照，空白瓶中不加样品，用水代替，其他完全相同。（根据供试品含量可适当调整取样量及消化方式，最终制成约含核苷酸100μg/ml的消化液） 2.2.2 取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660）。空白对照同样操作。
2.3 供试品中无机磷含量测定
另取供试品适量，用水稀释到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660）。
2.4 结果计算
首先制作标准磷曲线，以5.2项中消化和5.3项中未消化的供试品溶液测得的A660 从标准曲线上查出总磷和无机磷的量，按式计算供试品中核苷酸的含量：
3 结果
3.1 线性和范围
3.1.1测定方法：取标准磷溶液（5μg/mL）0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5， 3.0mL，用水补足到
3.0mL，含磷量分别为0，2.5，5.0，7.5，10，12.5，15.0μg，加定磷试剂3.0mL后摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸光度（A660），0点为空白，以含磷量（μg） 为横坐标，以吸光度值（A660）为纵坐标绘制标准曲线。
3.1.2 标准曲线绘制：
标准曲线
3.1.3 单项结论：标准曲线为Y=0.04998X+0.00382，相关系数r=0.9999。
3.2 精密度
3.2.1 重复性
3.2.1.1对照测定：精密吸取6组标准磷溶液（5μg/mL）各1.0mL用水补足到3.0mL，加定磷试剂3.0mL后摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸光度（A660）。结果见表2。
3.2.1.2 供试品的测定：供试品为珍奥核诺胶囊（批号：20130302，理论含量：33.6%）;称取供试品15mg，置于消化瓶中，加入10mL浓硫酸及50mg催化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑色变成淡黄色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至溶液呈无色至淡蓝色为止，冷至室温，用纯化水定容到50mL，与样品消化的同时做空白对照，空白瓶中不加样品，用水代替，其他完全相同。取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），空白对照同样操作，测定总磷含量;另取供试品15mg，用水定容到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），测定无机磷含量，根据公式计算出供试品核苷酸的含量。结果见表3
3.2.1.3 单项结论：以上测定结果的RSD值分别为0.40%、0.49%.
3.2.2中间精密度
3.2.2.1 供试品的测定：3名分析人员用不同仪器对供试品进行测定，供试品为珍奥核诺胶囊（批号：20130302，理论含量：33.6%）;称取供试品15mg，置于消化瓶中，加入10mL浓硫酸及50mg催化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑色变成淡黄色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至溶液呈无色至淡蓝色为止，冷至室温，用纯化水定容到50mL，与样品消化的同时做空白对照，空白瓶中不加样品，用水代替，其他完全相同。取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），空白对照同样操作，测定总磷含量;另取供试品15mg，用水定容到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），测定无机磷含量，根据公式计算出供试品核苷酸的含量。结果见表4
3.2.2.2 标准曲线：
（1）Y=0.04899X+0.00260 相关系数r为0.9997
（2）Y=0.05017X-0.00140 相关系数r为0.9998
（3）Y=0.05073X-0.00854 相关系数r为0.9999
3.2.2.3 实验结果
3.2.2.4 单项结论：测定结果的RSD值为0.40%。
3.3 准确度
3.3.1加样回收率：精密称取9份供试品各15mg，分为低、中、高3组，每组3个样品，分别往各组供试品中加入含400μg、500μg、600μg的标准磷储备液置于消化瓶中，加入10mL浓硫酸及50mg催化剂，在消化炉上加热至发白烟，样品由黑色变成淡黄色，取下稍冷，加数滴30%过氧化氢液，继续加热至溶液呈无色至淡蓝色为止，冷至室温，用纯化水定容到100mL，与样品消化的同时做空白对照，空白瓶中不加样品，用水代替，其他完全相同。取消化液1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），空白对照同样操作，测定总磷含量;另取供试品15mg，用水定容到50ml，取1.0ml，加水2.0ml，定磷试剂3.0ml，摇匀，于45℃水浴中放置20分钟，于660nm波长处测定吸收度（A660），测定无机磷含量，根据公式计算出供试品核苷酸的含量。结果见表4（供试品磷含量μg=15mg×33.45%×1000÷11÷100）
3.3.2 单项结论：回收率结果在98.6%-101.9%，RSD=1.29%
3.4 对比实验
3.4.1 方法
方法一：保健食品中核苷酸的测定方法（2003）;
方法二：本方法（定磷法）。
3.4.2 对比结果
3.4.2.1 供试品
供试品：珍奥核诺胶囊（批号：20130302），理论含量：33.6%。
3.4.2.2 实验数据
4 讨论
试验结果证明所建立的定磷法简单、灵敏、快速、准确，适用于以核苷酸为原料保健食品中核苷酸含量测定的方法。但由于本方法通过测定有机磷来推算核苷酸的含量，因此当配方中含其他有机磷化合物时，本方法不适用，存在局限性。
参考文献：
[1] 抗坏血酸一钼蓝显色定磷法检测转移因子制剂中核苷酸的含量， 宋红波，黑龙江医药Heilongjiang Medicine Journal Vo1.22 No.2 2009;
[2] 分光光度法测定有机磷的研究，王春林，广州化学;
[3] 寡核苷酸类药物磷的定性定量分析，李保山，CHINA MEDICINE AND PHARMACY，2013年4月第3卷第8。