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摘要 通过设置不同pH梯度，研究土壤pH对根肿菌侵染及病害发生的影响。结果表明：土壤酸性时病菌侵染速度快，碱性时慢，而强酸性和碱性土壤条件则抑制孢子萌发；pH为6.0时最有利于根肿菌休眠孢子萌发，萌发率最高，为53.96%；碱性条件可使初级原生质团变形凝结成球状，不能正常分裂或延迟形成游动孢子囊，从而不利于根肿菌侵染。白菜发病率与病情指数随pH升高，呈先上升后下降趋势。其中，pH为5.0时，发病率和病情指数最高，pH 7.0～8.0时发病轻。因此，适宜的偏酸性环境条件下，通过作用于病菌休眠孢子萌发和侵染，提高病害危害程度，而中性或碱性条件干扰该过程并降低病害发生。
关键词 十字花科蔬菜根肿病； 芸薹根肿菌； 土壤pH
中图分类号： S 436.341.19
文献标识码： A
DOI： 10.3969/j.issn.05291542.2015.06.009
Abstract A series of pH gradients were set up in order to investigate the effects of pH on Plasmodiophora brassicae infection and disease development. The results indicated that P.brassicae infection speed was higher under the acid conditions than under alkaline conditions. The highest germination rate of spore was 53.96% at pH 6.0. However， strong acidic and alkaline conditions inhibited germination of resting spores. Alkaline condition could make primary protoplasts deformed and condensed into globular shape. The primary protoplasts could not divide properly or delayed forming a zoosporangium. So the infection of P.brassicae was suppressed. Incidence and disease index increased with pH， with the highest level at pH 5.0， followed by the decrease. The incidence and disease index were lower at pH 7.0-8.0. So， the suitably low pH could promote the disease by acting on the resting spore germination and infection. However neutral or alkaline conditions might interfere with this process and reduced disease development.
Key words cruciferous vegetable clubroot； Plasmodiophora brassicae； soil pH
十字花科作物根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）引起的一种世界性病害，一直是十字花科作物生产上的重要病害。该病害在世界不同国家和地区引起10%～15%的产量损失[12]，重病区则高达70%[3]。几乎所有十字花科作物，如油菜、卷心菜、甘蓝、大白菜和芥菜等均会受到不同程度的危害[4]。
影响根肿病发生的因素有很多，其中土壤环境条件是最为重要的因素，包括土壤含水量、酸碱度和营养元素等，而土壤酸碱度主要取决于土壤溶液中氢离子的浓度。田间根肿病的发生与土壤pH有密切关系，从休眠孢子萌发到根毛侵入时期即初级游动孢子时期是病原菌生活史中最易受到pH影响的时期[56]。目前，环境污染及大量酸性肥料的施用造成的土壤酸化是根肿病发生严重的主要原因[1]。为进一步了解pH对根肿病发生的影响，本试验通过设置不同的土壤pH，观察根肿菌的侵染发育，明确pH对病菌各阶段的作用及对病害发生的影响。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试品种为对芸薹根肿菌高感品种‘鲁白六号832’大白菜。病原为采自湖北省宜昌市当阳两河镇双龙村的油菜根肿病菌。
1.2 试验方法
1.2.1 白菜幼苗的培养
本试验植株的培养采用沙营养液栽培法，在大枪头中种植白菜幼苗（图1）。培养方法参考Donald的方法[3]并略有改动。培养液pH分别为38、42、5.0、5.4、6.0、7.0、8.0，同时设置接种与未接种对照，共14个处理，每个处理设置3个重复，每1个重复处理不少于20株苗。营养液每隔3 d补充1次，每星期更换1次，以保障营养液营养成分以及pH的稳定性。
1.2.2 休眠孢子悬浮液的制备及接种方法
取5 g左右冷冻保存的肿根在水中解冻，冲洗干净后用75%乙醇表面消毒30 s，然后用匀浆机打成匀浆，8层纱布过滤；滤液转移到50 mL离心管中，1 450 g离心15 min，沉淀用无菌水洗2次，悬浮于少量无菌水中；将悬浮液缓慢铺在10 mL percoll混合液（9 mL percoll 1 mL 8.5% NaCl）表面，然后以1 010 g离心10 min；将上清液转移至新的离心管中，与40 mL无菌水混合，再于1 450 g离心15 min；将得到的沉淀用无菌水洗3次，最后将沉淀溶于少量无菌水中，置于4 ℃冰箱备用[7]。 当白菜幼苗长至2片子叶时，接种根肿菌。将根肿菌休眠孢子配制成浓度为108个/mL的悬浮液，每植株用800 μL菌悬液灌根接种[8]。
1.2.3 根肿菌休眠孢子萌发观察
采用醋酸地衣红染色法[9]观察休眠孢子萌发情况。45 mL醋酸与55 mL蒸馏水混合，加热，缓慢加入地衣红粉末1 g搅拌溶解后缓缓煮沸，配制成1%醋酸地衣红染色液，过滤后储存在棕色瓶中备用。在载玻片上滴1滴孢子悬浮液，自然条件下或酒精灯上微热干燥，加1滴醋酸地衣红染液染色2 min，用流水清洗后在显微镜下观察。
1.2.4 根肿菌DNA的提取
在接种后第2天和第3天，剪取适量白菜幼苗根部，水洗干净后提取基因组DNA。称取0.5 g左右根组织于研钵中，加入1 mL裂解缓冲液[含400 mmol/L TrisHCl（pH 8.0），60 mmol/L EDTA（pH 8.0），15 mmol/L NaCl，1%SDS]浸浴10 min后再进行研磨；将研磨液转入1.5 mL离心管，加入150 μL醋酸钾溶液（pH 4.8）振荡片刻后，11 000 g离心2 min；将上清液转入另一1.5 mL离心管中，11 000 g重复离心一次；取上清液加入等体积氯仿∶异戊醇（V∶V=24∶1），5 000 g离心8 min；取上清液加入等体积预冷的异丙醇，混匀后常温下放置20 min；11 000 g离心4 min，弃上清，沉淀用70%乙醇冲洗2～3次，并在10 000 r/min下离心2 min；弃上清，沉淀风干后溶于适量TE。
1.2.5 根肿菌侵染的PCR检测
采用PCR法，利用检测根肿菌的特异性引物[10]，pb1b： 5′GTGGTCGAACTTCATTAAATTTGGGCTCTT3′；pb2b： 5′TTCACCTACGGAACGTATATGTGCATGTGA3′ 检测植株是否被根肿菌侵染。反应体系：模板DNA 1 μL、引物pb1b、pb2b（10 mmol/L）各1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O补足至25 μL。反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35循环；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物，经1%琼脂糖凝胶在120 V恒压下电泳30 min检测，经溴化乙锭染色后在紫外光下观察电泳结果。
1.2.6 根毛侵染观察
接种后每天每处理拔取3株幼苗，根系先用自来水冲洗干净，自根系下胚轴以下1 cm处剪取根系1 cm，置于乙酸-乙醇（V∶V=1∶1）固定液中固定5～10 min，然后再置于苯酚苯胺蓝染液中染色1 min左右，在光学显微镜下随机观察100个根毛侵染情况。
1.2.7 病害调查
洗根调查：播种后35 d发病情况基本稳定，将每个处理的幼苗拔出并洗根，洗根时注意不能损伤小的侧根，根据分级标准进行分级。
分级标准[11]：0级，根部无肿瘤，根系发育正常；1级，侧根着生少许肿瘤或主根稍有膨粗，有小但肉眼清晰可见的结节状肿块；3级，主根着生肿瘤，有明显的较大结节状或球状肿块；5级，主根上出现大的肿瘤，膨大成纺锤形，大的根肿一直延伸到下胚轴，植株矮小，生长停止；7级，主根形成很大纺锤形肿瘤，植株生长发育停止，并伴有萎蔫死亡。根据病情调查结果按下式计算病情指数：
2 结果与分析
2.1 pH对休眠孢子萌发的影响
以不同pH的营养液处理休眠孢子，在25 ℃的黑暗条件下培养2 d和6 d，利用醋酸地衣红定量检测休眠孢子萌发率，已萌发的孢子不着色，未萌发的则被染成红色。结果显示，培养时间延长有利于孢子萌发，随着pH的升高，休眠孢子的萌发率呈先升高后降低的趋势。其中，pH为 6.0时休眠孢子萌发率最高，培养2 d和6 d的萌发率分别为4672%和53.96%，其他pH处理条件下萌发率相对较低（图2）。表明中偏酸性条件有利于根肿菌休眠孢子的萌发，而强酸性和碱性条件则抑制休眠孢子萌发。
2.2 PCR法检测芸薹根肿菌的侵染情况
接种后第2天和第3天，采用PCR方法检测根肿菌的侵染情况。结果显示，接种后第2天，在土壤pH 3.8、4.2、5.0、5.4和6.0的条件下培养的幼苗中检测到根肿菌。接种后第3天所有土壤pH处理的幼苗都感染了根肿菌（表1），但pH 8.0处理的条带没有其他处理亮。根据试验结果认为，土壤为酸性时利于根肿菌侵染，而碱性时可延缓其侵染。
2.3 pH对根肿菌侵染根毛的影响
接种后每天取样，在光学显微镜下观察根毛被侵染的情况。结果显示，pH 3.8、4.2、5.0、5.4、6.0、7.0处理其根毛都受到根肿菌侵染，且都发现了游动孢子囊。pH为8.0时，只发现少数根毛受到侵染，且都为初始原生质团，没有发现游动孢子囊；此外，有些受到侵染的根毛中原生质团变形凝结成球，而不是分裂形成游动孢子囊（图3）。因此，推测碱性条件使初级原生质团不能正常分裂或延迟形成游动孢子囊，从而影响了根肿菌的侵染和发育，进而抑制了肿根的形成。
2.4 土壤pH对根肿病发生的影响
利用休眠孢子悬浮液灌根法，将根肿菌接种到不同pH沙营养液培养的大白菜根部，观察根肿病发生危害情况。未接种处理的结果显示，土壤pH 3.8或8.0对根系生长有一定的影响，而酸性或中性条件根系生长健康；接种根肿菌的结果显示，不同土壤pH对根系及肿瘤形成的影响明显不同，在品种、栽培管理等相同条件下，酸性土壤较碱性土壤发病重。碱性（pH 8.0）对根系生长虽略有影响，但不形成肿瘤。随着pH的降低，白菜根肿病根部肿大情况逐渐明显，其中当pH为5.4、5.0、4.2时，根部明显肿大呈圆球形，pH 5.0处理下，大白菜根部有少量部分变为黑色。强酸时（pH 3.8）根系少而短小，且变形（图4）。表明pH相对越低，根部肿大情况越明显，pH相对越高，根部肿大情况越不明显。 不同pH处理下，白菜根肿病的发病率和病情指数也有差异。结果显示，随着pH的升高，发病率和病情指数均呈先上升后下降趋势，不同处理之间差异显著（图5）。当pH为5.0时，发病率和病情指数最高，分别为71.54%和35.87，其他处理较低。当pH为7.0～8.0时白菜发病轻，pH 8.0时无明显症状表现。说明pH相对较低时，发病严重，碱性时则不利于发病。
3 结论与讨论
国内外研究表明，土壤pH与田间根肿病的发生有密切关系。由于富有食品工厂沉积物堆肥（food factory sludge compost，FSC）的施用，导致土壤pH由6.0变为6.9，根际土壤中休眠孢子萌发率和根毛感染率显著减少，农家肥（farmyard manure，FYM）和FSC与易感病土壤混合（2.5%，W/W）可抑制病害感染，其中适宜的FSC微粒（≤5 mm）抑制感染作用明显，且相对更有效地提高了土壤的pH[12]。休眠孢子在弱酸条件下萌发情况较好，最适pH为6.0～6.7，以pH 6.3时萌发率最高，碱性或中强酸性时休眠孢子的萌发率较低[1]。罗一帆等人的研究发现，不同油菜品种发生根肿病时，根毛侵染最适pH有所不同，其中‘黄油菜’、‘丰抗70’、‘白油菜’和‘川油21’等4个品种根毛侵染高峰pH分别是5.6、4.9、4.9和5.6[13]。罗春红研究表明：适宜根肿病发生的pH为6.2，pH 8.0以上发病少[14]，而余汉清等认为土壤pH与发病率无关[15]。
本研究设置不同pH梯度，系统明晰了根肿菌侵染与病害发生随pH的变化趋势。随着pH升高，休眠孢子萌发率、发病率与病情指数均呈先上升后下降趋势。pH为6.0时休眠孢子萌发率最高，pH过低不利于孢子萌发。虽然休眠孢子萌发率在pH5.0时为6.0时的50%，但pH 5.0处理的病情指数与发病率最高，说明酸性条件利于病害发生主要作用于休眠孢子萌发后期。pH 7.0处理休眠孢子萌发率、病情指数与发病率明显降低，且根系生长健康，根部肿大不明显。pH为8.0时病情指数与发病率均为0，休眠孢子萌发率和根毛侵染率最低，且发现有些根毛中的原生质团变形凝结成球状，一定程度上说明碱性条件是通过干扰和延迟游动孢子囊的形成以及影响皮层侵染来降低病害的发生，但该处理植株生长矮小，亦不可作为防病参考依据。因此，在田间管理上可通过适当施加生石灰、有机肥等提高土壤的pH至中性或弱碱性，创造不利于根肿病菌侵染的条件，进而减轻根肿病的危害。
参考文献
[1]Dixon G R.Plasmodiophora brassicae in its environment [J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2009， 28（3）： 212228.
[2]Landry B S， Hubert N， Crête R， et al. A genetic map for Brassica oleracea based on RFLP markers detected with expressed DNA sequences and mapping of resistance genes to race 2 of Plasmodiophora brassicae （Woronin）[J]. Genome， 1992， 35（3）： 409420.
[3]Donald E C， Cross S J， Lawrence J M，et al. Pathotypes of Plasmodiophora brassicae， the cause of clubroot， in Australia[J].The Annals of Applied Biology，2006，148（3）：239244.
[4]徐瑞英，徐瑞芹. 十字花科根肿病的发生与防治[J].吉林蔬菜，2006（2）：4142.
[5]Kageyama K， Asano T.Life Cycle of Plasmodiophora brassicae [J]. Journal of Plant Growth Regulation，2009，28（3）：203211.
[6]Donald E C， Porter I J.A sandsolution culture technique used to observe the effect of calcium and pH on root hair and cortical stages of infection by Plasmodiophora brassicae [J]. Australasian Plant Pathology， 2004， 33（4）： 585589.
[7]郭向华，肖崇刚.甘蓝根肿病菌的生物学特性及致病研究[D].重庆：西南农业大学，2001.
[8]周永红，孙保亚，沈向群.大白菜根肿病抗病接种浓度的研究[J].辽宁农业科学，2007（3）：3435.
[9]Naiki T， Dixion G R，Ikegami H.Quantitative estimation of spore germination of Plasmodiophora brassicae [J]. Transactions of the British Mycological Society，1987，89（4）：569609.
[10]Cao T， Srivastava S， Rahman M H， et al. Proteomelevel changes in the roots of Brassica napus as a result of Plasmodiophora brassicae infection [J]. Plant Science， 2008， 174（1）： 97115.
[11]张振海.十字花科蔬菜对根肿病的抗感性及病菌侵染寄主的组织学观察[D].武汉：华中农业大学，2013.
[12]Niwa R， Kumei T， Nomura Y， et al. Increase in soil pH due to Carich organic matter application causes suppression of the clubroot disease of crucifers [J]. Soil Biology
关键词 十字花科蔬菜根肿病； 芸薹根肿菌； 土壤pH
中图分类号： S 436.341.19
文献标识码： A
DOI： 10.3969/j.issn.05291542.2015.06.009
Abstract A series of pH gradients were set up in order to investigate the effects of pH on Plasmodiophora brassicae infection and disease development. The results indicated that P.brassicae infection speed was higher under the acid conditions than under alkaline conditions. The highest germination rate of spore was 53.96% at pH 6.0. However， strong acidic and alkaline conditions inhibited germination of resting spores. Alkaline condition could make primary protoplasts deformed and condensed into globular shape. The primary protoplasts could not divide properly or delayed forming a zoosporangium. So the infection of P.brassicae was suppressed. Incidence and disease index increased with pH， with the highest level at pH 5.0， followed by the decrease. The incidence and disease index were lower at pH 7.0-8.0. So， the suitably low pH could promote the disease by acting on the resting spore germination and infection. However neutral or alkaline conditions might interfere with this process and reduced disease development.
Key words cruciferous vegetable clubroot； Plasmodiophora brassicae； soil pH
十字花科作物根肿病是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae Woronin）引起的一种世界性病害，一直是十字花科作物生产上的重要病害。该病害在世界不同国家和地区引起10%～15%的产量损失[12]，重病区则高达70%[3]。几乎所有十字花科作物，如油菜、卷心菜、甘蓝、大白菜和芥菜等均会受到不同程度的危害[4]。
影响根肿病发生的因素有很多，其中土壤环境条件是最为重要的因素，包括土壤含水量、酸碱度和营养元素等，而土壤酸碱度主要取决于土壤溶液中氢离子的浓度。田间根肿病的发生与土壤pH有密切关系，从休眠孢子萌发到根毛侵入时期即初级游动孢子时期是病原菌生活史中最易受到pH影响的时期[56]。目前，环境污染及大量酸性肥料的施用造成的土壤酸化是根肿病发生严重的主要原因[1]。为进一步了解pH对根肿病发生的影响，本试验通过设置不同的土壤pH，观察根肿菌的侵染发育，明确pH对病菌各阶段的作用及对病害发生的影响。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试品种为对芸薹根肿菌高感品种‘鲁白六号832’大白菜。病原为采自湖北省宜昌市当阳两河镇双龙村的油菜根肿病菌。
1.2 试验方法
1.2.1 白菜幼苗的培养
本试验植株的培养采用沙营养液栽培法，在大枪头中种植白菜幼苗（图1）。培养方法参考Donald的方法[3]并略有改动。培养液pH分别为38、42、5.0、5.4、6.0、7.0、8.0，同时设置接种与未接种对照，共14个处理，每个处理设置3个重复，每1个重复处理不少于20株苗。营养液每隔3 d补充1次，每星期更换1次，以保障营养液营养成分以及pH的稳定性。
1.2.2 休眠孢子悬浮液的制备及接种方法
取5 g左右冷冻保存的肿根在水中解冻，冲洗干净后用75%乙醇表面消毒30 s，然后用匀浆机打成匀浆，8层纱布过滤；滤液转移到50 mL离心管中，1 450 g离心15 min，沉淀用无菌水洗2次，悬浮于少量无菌水中；将悬浮液缓慢铺在10 mL percoll混合液（9 mL percoll 1 mL 8.5% NaCl）表面，然后以1 010 g离心10 min；将上清液转移至新的离心管中，与40 mL无菌水混合，再于1 450 g离心15 min；将得到的沉淀用无菌水洗3次，最后将沉淀溶于少量无菌水中，置于4 ℃冰箱备用[7]。 当白菜幼苗长至2片子叶时，接种根肿菌。将根肿菌休眠孢子配制成浓度为108个/mL的悬浮液，每植株用800 μL菌悬液灌根接种[8]。
1.2.3 根肿菌休眠孢子萌发观察
采用醋酸地衣红染色法[9]观察休眠孢子萌发情况。45 mL醋酸与55 mL蒸馏水混合，加热，缓慢加入地衣红粉末1 g搅拌溶解后缓缓煮沸，配制成1%醋酸地衣红染色液，过滤后储存在棕色瓶中备用。在载玻片上滴1滴孢子悬浮液，自然条件下或酒精灯上微热干燥，加1滴醋酸地衣红染液染色2 min，用流水清洗后在显微镜下观察。
1.2.4 根肿菌DNA的提取
在接种后第2天和第3天，剪取适量白菜幼苗根部，水洗干净后提取基因组DNA。称取0.5 g左右根组织于研钵中，加入1 mL裂解缓冲液[含400 mmol/L TrisHCl（pH 8.0），60 mmol/L EDTA（pH 8.0），15 mmol/L NaCl，1%SDS]浸浴10 min后再进行研磨；将研磨液转入1.5 mL离心管，加入150 μL醋酸钾溶液（pH 4.8）振荡片刻后，11 000 g离心2 min；将上清液转入另一1.5 mL离心管中，11 000 g重复离心一次；取上清液加入等体积氯仿∶异戊醇（V∶V=24∶1），5 000 g离心8 min；取上清液加入等体积预冷的异丙醇，混匀后常温下放置20 min；11 000 g离心4 min，弃上清，沉淀用70%乙醇冲洗2～3次，并在10 000 r/min下离心2 min；弃上清，沉淀风干后溶于适量TE。
1.2.5 根肿菌侵染的PCR检测
采用PCR法，利用检测根肿菌的特异性引物[10]，pb1b： 5′GTGGTCGAACTTCATTAAATTTGGGCTCTT3′；pb2b： 5′TTCACCTACGGAACGTATATGTGCATGTGA3′ 检测植株是否被根肿菌侵染。反应体系：模板DNA 1 μL、引物pb1b、pb2b（10 mmol/L）各1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O补足至25 μL。反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35循环；最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR产物，经1%琼脂糖凝胶在120 V恒压下电泳30 min检测，经溴化乙锭染色后在紫外光下观察电泳结果。
1.2.6 根毛侵染观察
接种后每天每处理拔取3株幼苗，根系先用自来水冲洗干净，自根系下胚轴以下1 cm处剪取根系1 cm，置于乙酸-乙醇（V∶V=1∶1）固定液中固定5～10 min，然后再置于苯酚苯胺蓝染液中染色1 min左右，在光学显微镜下随机观察100个根毛侵染情况。
1.2.7 病害调查
洗根调查：播种后35 d发病情况基本稳定，将每个处理的幼苗拔出并洗根，洗根时注意不能损伤小的侧根，根据分级标准进行分级。
分级标准[11]：0级，根部无肿瘤，根系发育正常；1级，侧根着生少许肿瘤或主根稍有膨粗，有小但肉眼清晰可见的结节状肿块；3级，主根着生肿瘤，有明显的较大结节状或球状肿块；5级，主根上出现大的肿瘤，膨大成纺锤形，大的根肿一直延伸到下胚轴，植株矮小，生长停止；7级，主根形成很大纺锤形肿瘤，植株生长发育停止，并伴有萎蔫死亡。根据病情调查结果按下式计算病情指数：
2 结果与分析
2.1 pH对休眠孢子萌发的影响
以不同pH的营养液处理休眠孢子，在25 ℃的黑暗条件下培养2 d和6 d，利用醋酸地衣红定量检测休眠孢子萌发率，已萌发的孢子不着色，未萌发的则被染成红色。结果显示，培养时间延长有利于孢子萌发，随着pH的升高，休眠孢子的萌发率呈先升高后降低的趋势。其中，pH为 6.0时休眠孢子萌发率最高，培养2 d和6 d的萌发率分别为4672%和53.96%，其他pH处理条件下萌发率相对较低（图2）。表明中偏酸性条件有利于根肿菌休眠孢子的萌发，而强酸性和碱性条件则抑制休眠孢子萌发。
2.2 PCR法检测芸薹根肿菌的侵染情况
接种后第2天和第3天，采用PCR方法检测根肿菌的侵染情况。结果显示，接种后第2天，在土壤pH 3.8、4.2、5.0、5.4和6.0的条件下培养的幼苗中检测到根肿菌。接种后第3天所有土壤pH处理的幼苗都感染了根肿菌（表1），但pH 8.0处理的条带没有其他处理亮。根据试验结果认为，土壤为酸性时利于根肿菌侵染，而碱性时可延缓其侵染。
2.3 pH对根肿菌侵染根毛的影响
接种后每天取样，在光学显微镜下观察根毛被侵染的情况。结果显示，pH 3.8、4.2、5.0、5.4、6.0、7.0处理其根毛都受到根肿菌侵染，且都发现了游动孢子囊。pH为8.0时，只发现少数根毛受到侵染，且都为初始原生质团，没有发现游动孢子囊；此外，有些受到侵染的根毛中原生质团变形凝结成球，而不是分裂形成游动孢子囊（图3）。因此，推测碱性条件使初级原生质团不能正常分裂或延迟形成游动孢子囊，从而影响了根肿菌的侵染和发育，进而抑制了肿根的形成。
2.4 土壤pH对根肿病发生的影响
利用休眠孢子悬浮液灌根法，将根肿菌接种到不同pH沙营养液培养的大白菜根部，观察根肿病发生危害情况。未接种处理的结果显示，土壤pH 3.8或8.0对根系生长有一定的影响，而酸性或中性条件根系生长健康；接种根肿菌的结果显示，不同土壤pH对根系及肿瘤形成的影响明显不同，在品种、栽培管理等相同条件下，酸性土壤较碱性土壤发病重。碱性（pH 8.0）对根系生长虽略有影响，但不形成肿瘤。随着pH的降低，白菜根肿病根部肿大情况逐渐明显，其中当pH为5.4、5.0、4.2时，根部明显肿大呈圆球形，pH 5.0处理下，大白菜根部有少量部分变为黑色。强酸时（pH 3.8）根系少而短小，且变形（图4）。表明pH相对越低，根部肿大情况越明显，pH相对越高，根部肿大情况越不明显。 不同pH处理下，白菜根肿病的发病率和病情指数也有差异。结果显示，随着pH的升高，发病率和病情指数均呈先上升后下降趋势，不同处理之间差异显著（图5）。当pH为5.0时，发病率和病情指数最高，分别为71.54%和35.87，其他处理较低。当pH为7.0～8.0时白菜发病轻，pH 8.0时无明显症状表现。说明pH相对较低时，发病严重，碱性时则不利于发病。
3 结论与讨论
国内外研究表明，土壤pH与田间根肿病的发生有密切关系。由于富有食品工厂沉积物堆肥（food factory sludge compost，FSC）的施用，导致土壤pH由6.0变为6.9，根际土壤中休眠孢子萌发率和根毛感染率显著减少，农家肥（farmyard manure，FYM）和FSC与易感病土壤混合（2.5%，W/W）可抑制病害感染，其中适宜的FSC微粒（≤5 mm）抑制感染作用明显，且相对更有效地提高了土壤的pH[12]。休眠孢子在弱酸条件下萌发情况较好，最适pH为6.0～6.7，以pH 6.3时萌发率最高，碱性或中强酸性时休眠孢子的萌发率较低[1]。罗一帆等人的研究发现，不同油菜品种发生根肿病时，根毛侵染最适pH有所不同，其中‘黄油菜’、‘丰抗70’、‘白油菜’和‘川油21’等4个品种根毛侵染高峰pH分别是5.6、4.9、4.9和5.6[13]。罗春红研究表明：适宜根肿病发生的pH为6.2，pH 8.0以上发病少[14]，而余汉清等认为土壤pH与发病率无关[15]。
本研究设置不同pH梯度，系统明晰了根肿菌侵染与病害发生随pH的变化趋势。随着pH升高，休眠孢子萌发率、发病率与病情指数均呈先上升后下降趋势。pH为6.0时休眠孢子萌发率最高，pH过低不利于孢子萌发。虽然休眠孢子萌发率在pH5.0时为6.0时的50%，但pH 5.0处理的病情指数与发病率最高，说明酸性条件利于病害发生主要作用于休眠孢子萌发后期。pH 7.0处理休眠孢子萌发率、病情指数与发病率明显降低，且根系生长健康，根部肿大不明显。pH为8.0时病情指数与发病率均为0，休眠孢子萌发率和根毛侵染率最低，且发现有些根毛中的原生质团变形凝结成球状，一定程度上说明碱性条件是通过干扰和延迟游动孢子囊的形成以及影响皮层侵染来降低病害的发生，但该处理植株生长矮小，亦不可作为防病参考依据。因此，在田间管理上可通过适当施加生石灰、有机肥等提高土壤的pH至中性或弱碱性，创造不利于根肿病菌侵染的条件，进而减轻根肿病的危害。
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