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【摘要】目的：研究肌酐产物对红细胞的毒性作用。方法：用液相色谱仪分析尿毒症患者肠道细菌分解肌酐的产物。用分解肌酐能力最强的肺炎克雷伯菌与肌酐共同培养，取其培养液与健康红细胞孵化，观察溶血情况；并分别加入葡萄糖、ATP（三磷酸腺苷）、GSH（谷胱甘肽），了解以上物质对溶血的纠正情况；并测定红细胞内GSH的浓度。结果：肠道细菌分解肌酐产生甲胺。肌酐组溶血度1.52%，肌酐产物组3.52%，后者较前者的毒性强，加重红细胞溶血（P<0.05）；加入葡萄糖、ATP溶血不纠正，加入GSH明显纠正（P<0.001）；GSH组溶血度0.252%，正常对照组0.192%，二者差异无显著性。肌酐组红细胞内GSH含量2152.98μmol/L，肌酐产物组1047.96μmol/L，后者红细胞内GSH含量明显降低（P<0.001）。 结论：肌酐产物导致红细胞溶血，红细胞内GSH含量下降，补充GSH可纠正溶血。
【关键词】肌酐产物;红细胞;溶血;GSH
【中图分类号】R331.1【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2011）08-0385-03
The effection and mechanismthat products metabolism of creatinine treated erythrocytes
Hu Baiying
【Abstract】Objective: To study the toxicity that metabolite of creatinine treatederythrocytes.Methods：Metabolist of creatinine of uraemia intestinal bacteria was confirmed by HPLC. Klebsiella pneumoniae were incubated with creatinine, it’s metabolite and erythrocytes were incubated. hemolysiswas observed and GSH was determined in erythrocytes.Results：Metabolist of creatinine was methylamine, which can bring hemolysis of erythrocytes（P<0.05）. Degree of hemolysis of creatinine group was 1.52% and that of metabolist of creatinine group was 3.52%. Added up glucose and ATP, the hemolysis was not reversed. Added up GSH, it was reversed （P<0.01）. Concentration of GSH in erythrocytes of metabolist of creatinine group was decreased （P<0.001）. Concentration of GSH of creatinine group was 2152.98μmol/L and that of metabolist of creatinine group was 1047.49μmol/L. Conclusions：The toxicity to erythrocytes of the metabolite of creatinine is stronger than that of creatinine. The toxicity could be reversed by GSH.
【Key words】ErythrocytesGSHMetabolite of creatinine
慢性腎衰酶疗法，不仅要研究酶的结构、功能，最大限度发挥其分解作用，但对分解后的产物对人体的作用的研究也是至关重要的。毒素分解的下限物质必须是无毒的，对人体组织细胞安全。因而研究产物的毒性作用，是关系酶疗法的重要内容。国内对该领域报道较少，该部分则探讨肌酐产物对红细胞的影响。
1 材料
（1）利用肌酐能力最强的尿毒症患者的肠道细菌——肺炎克雷伯菌（实验已另文发表）。
（2）肌酐。
（3）正常健康志愿者的红细胞。
2 方法
2.1 肌酐产物的分析:肌酐对照液的配制：肌酐，用双蒸水配制成0.14mg/ml。
肌酐转化为甲基胍的对照液配制：肌酐230 mg，三氯化铁270 mg，1%过氧化氢100 ml，于震荡恒温培养箱，25℃温育3小时，即得。其为肌酐、甲基胍及中间代谢产物。
肠道细菌作用于肌酐的代谢产物的配制：肌酐1200μmol/ml溶液1ml，肠道细菌1菌环，37℃恒温培养箱培养48小时，离心取上清液。
细菌将肌酐转化为甲胺的对照液配制：取分解肌酐为甲胺的土壤细菌斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）一菌环，余操作同3。
色谱图制作用微量移液器加样品于液相色谱反向Devolosil ODS-5？m柱（4.6*150mm），0.1%三氟乙酸作为洗脱液，于色谱仪中缓慢洗脱。之前，需用同一洗脱液平衡色谱仪。
2.2 溶液配置
A液：含有1200μmol/L肌酐的无蛋白培养基。
B液：A液1ml，加入利用肌酐能力最强的尿毒症患者的肠道细菌——肺炎克雷伯菌一菌环，放入37℃恒温培养箱培养48h离心取上清液，纠正PH值，微孔滤纸过滤除菌，作为肌酐产物备用。
G液：不含肌酐的无蛋白培养基1 ml，加入肺炎克雷伯菌一菌环，放入37℃恒温培养箱培养48h离心取上清液，纠正PH值，微孔滤纸过滤除菌，作为细菌产物备用。
脱纤维蛋白抗凝血：无菌抽取健康志愿者静脉血100 ml，注入消毒的带玻璃珠的三角烧瓶内适当摇动脱去纤维。
分组：2ml脱纤维蛋白抗凝血基础上每管加入A液0.1ml 为A组；B液0.1ml 为B组；在B液组的基础上加入10%葡萄糖0.1ml为葡萄糖组，加入PH6.8的2.5%的三磷酸腺酐（ATP）0.1ml者为ATP组，加入5mmol/L的还原型谷胱甘肽（GSH）0.1ml者为GSH组。抗凝血加入生理盐水0.1ml 者为正常对照F组，加入G液0.1ml者为G组。
2.3 溶血试验（参照红细胞自身溶血试验设计）：取脱纤维蛋白血1ml分离血清待作空白管用；另1ml置冰箱作溶血管。余血每管取2ml按A、B、葡萄糖、ATP、GSH、F、G 5组，分别进行实验。
37℃温育48h后轻轻将试管混匀，并各取1ml作红细胞压积，另1ml经离心后吸上清液0.5ml于另一管中，并各再加入0.04%氨水4.5ml。
用520nm（绿色）滤光板比色，记录各测定管的光密度。用未温育血清0.5ml，加4.5ml氨水为空白对照管。
溶血管：取未温育全血0.1ml加氨水20ml按上法比色。
计算：溶血度%测定管读数*（100-红细胞压积）/溶血管读数*20
2.4 谷胱甘肽测定：无菌抽取健康志愿者静脉血50ml肝素抗凝。
在每管取2ml抗凝血的基础上，加入0.1 ml生理盐水为生理盐水组；加入A液0.1ml 为A组；B液0.1ml 为B组，G液0.1ml为G组。
各组标本于37℃恒温箱温育48h。
各取0.2ml温育后的血，按《临床血液学检验》中还原型谷胱甘肽的比色法测定。
2.5 统计学处理:实验数据用均数加减标准差（X±S）表示，两均数的比较用t检验，组间差用方差分析，显著性水准取双侧P<0.05。统计软件包用SPSS11.0。
2 结果
2.1 色谱图：
2.2 红细胞溶血情况,见表1。
2.3 红细胞内GSH的含量,见表2。
3 讨论
正常情况下肌酐在肠道的分布不足1%，大部分经肾脏排泄，还有一小部分经呼吸道排泄。尿毒症情况下，肾脏丧失对肌酐的排泄，其在胃肠
表1 实验各组溶血情况
与A液、G液组比较*P<0.05；与B液组比较#P<0.05；**P<0.001。
表2 实验各组培育48h后红细胞内GSH的测定
与A、G组及生理盐水组比较，*P<0.001。
道的排泄明显增加。14C标记的肌酐经肠道细菌代谢，其分解产物吸收入血后还可从呼吸道排泄。因此，尿毒症患者的肠道细菌对肌酐的代谢显的很重要。已有研究证明肠道细菌通过氧化还原反应分解利用肌酐[1]，肠道细菌可以产生肌酐酶。亦有学者发现尿毒症患者大便中肌酐酶的量增加，活性增强。肠内容物与肌酐共同孵育后可测出甲胺。有文献报道肠道细菌作用于肌酐的降解产物为甲胺，即肌酐在肠道细菌分泌的肌酐酶的作用下水解为肌酸，肌酸在经甲基甘氨酸代谢为甲胺。
甲胺的代谢毒性强，对神经系统，脉管系统，视网膜等都有较强的毒性。其吸收入血，在氨基脲敏感的胺氧化酶（SSAO）作用下，形成甲醛、过氧化氢[2]。SSAO广泛存在于血管内皮细胞、肾小管上皮细胞及血浆、血清中[3、4]。代谢过程中生成了氧化物质，消耗了过多的还原物质。
肌酐在哺乳动物体液内的代谢途径：肌酐氧化为氢氧化肌酐，氢氧化肌酐再水解为甲基胍[5]。其中，氢氧化肌酐和甲基胍的毒性均较肌酐强。肌酐是体内的一种还原物质，它能清除羟基自由基，其代谢产物毒性又强，所以说尿毒症患者体内的肌酐是一柄双刃剑。前述反应中，第一步为非酶促的氧化反应。只要有羟基自由基均可能发生反应。患者体内的细菌对肌酐的代谢是否还可遵循上述途径产生甲基胍？
为了进行证实，我们用液相色谱仪对细菌代谢产物进行分析，结果肠道细菌分解肌酐的图谱与分解肌酐为甲胺的土壤细菌的图谱一致。与转化成甲基胍的对照图不一致。所以尿毒症患者肠道细菌对肌酐的代谢与肌酐在哺乳动物体液的代谢不同，其代谢产物为甲胺。
尿毒症患者体内氧化应激增加。氧化应激程度可以用氢氧化肌酐和甲胺水平来衡量。从实验中我们可以看出，加入肌酐产物组溶血明显高于单纯肌酐组和单纯细菌产物组（P<0.05）。说明肌酐产物组的毒性较强。为寻求缓解红细胞破坏的因素，我们分别往代谢产物组加入葡萄糖，ATP，GSH。葡萄糖组溶血不但不纠正，反而比原来加重（P<0.05），ATP组溶血未能纠正，有加重趋势，但无统计学意义，与原产物组比较 P>0.05 。GSH组溶血明显纠正（P<0.001）。这就说明肌酐产物组消耗了过多的GSH，或抑制了GSH的生成。为了证实这个推测，我们进行了红细胞内的GSH测定。肌酐产物组明显降低，与单纯肌酐组，单纯细菌产物组及正常组比较P<0.001。这说明肌酐产物组的氧化性强，肠道细菌在代谢肌酐的过程中，代谢产物作用于红细胞的过程中的氧化物质和反应性氧类消耗了GSH或减少了GSH的生成。所以我们说肌酐产物组毒性更强。它可以使红细胞膜上的脂质过氧化。
慢性肾功能不全贫血的主要原因是促红细胞生成素的减少和红细胞寿命的缩短。许多作者还认为脂质过氧化也是红细胞溶血的重要原因。近年来大量文献报道慢性肾功能衰竭患者体内抗氧化能力减弱，反应性氧类（包括超氧阴离子、过氧化物和自由基）产生异常增多，氧化应激增强[6]。脂质过氧化反应增强。反应性氧类可攻击细胞膜不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物。红细胞膜是磷脂双分子层结构，有膜蛋白嵌于其中，即液态镶嵌模型。磷脂均为不饱和脂肪酸，甲醛、过氧化氢等与之反应，产生过氧化脂质，过氧化脂质再氧化不饱和脂肪酸，形成瀑布效应，最终产生丙二醛。甲醛、丙二醛都含有醛基，醛基可作用于膜磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的氨基，形成新的磷脂酰成分，进而影响脂质和蛋白质相互作用，导致膜结构和功能的异常。反应性氧类，醛基使膜蛋白上的巯基氧化，膜蛋白功能受损。GSH可以中断这些氧化反应。GSH是氧化物质清除剂，它可以与活性氧反应，清除自由基，使二者介导的氧化反应不进行，切断其瀑布效应。GSH含有巯基，该巯基在氧化的环境中首先与氧化物质结合，转变成氧化型谷胱甘肽，使磷脂、膜蛋白免受氧化损伤，所以不在出现溶血。此外,还原型谷胱甘肽的细胞保护作用还与其降解产物甘氨酸有关，甘氨酸具有强大的稳定细胞膜的功能。
因为GSH提供还原性巯基，使含巯基的酶和蛋白质巯基稳定。细胞内各重要代谢通路许多关键酶为含巯基的酶，或以巯基为活性中心，酶的活性对巯基的变化十分敏感。利用这个原理可解释为什么肌酐产物组加入葡萄糖、ATP溶血不纠正。因为红细胞膜上存在转运葡萄糖的特异性载体，即葡萄糖转运子。红细胞经其摄取葡萄糖。这些载体往往是些膜蛋白，这些膜蛋白被氧化失去转运葡萄糖的功能，即红细胞在这种条件下存葡萄糖利用障碍。加入葡萄糖只能使糖升高，高糖时葡萄糖转运子亦下调，NA+-k+-ATP酶的活性明顯降低，故溶血明显加重。
红细胞内NA+-k+-ATP酶又称钠泵，其作用是维持细胞内外阳离子的平衡，当细胞内钠离子增多或钾离子减少时，都会激活钠泵，把钠离子排出细胞外，把钾离子吸入细胞内，阳离子的主动转运需要ATP提供能量。NA+-k+-ATP酶也是蛋白酶，在肌酐产物组，酶蛋白被氧化，加入的ATP无法利用，故溶血不能纠正。同理，加入GSH后，钠泵不被氧化，不存在ATP利用障碍，溶血纠正。
红细胞中还存在着6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、己糖激酶、GSH-PX（谷胱甘肽过氧化物酶）、SOD（超氧化物歧化酶）等酶类和血红蛋白等物质。这些酶类和血红蛋白都可不同程度的被氧化。氧化物质存在多，氧化性强，氧化损伤就重；氧化物质存在少，氧化性弱，氧化损伤就轻。氧化程度的轻重直接影响了其功能。
上述酶类氧化，会出现葡萄糖、能量利用障碍，磷酸戊糖旁路受抑。磷酸戊糖旁路产生NADPH（还原型辅酶II）。由于人红细胞没有细胞核，磷酸戊糖途径的最终产物NADPH不可能用于核苷酸合成，只能用于维持细胞膜上GSH的还原状态。GSH是较敏感的并能反映组织细胞抗损伤能力及受损程度的观察指标。当血液中氧化物质增加时，红细胞将需要更多的NADPH用于被GSSG（氧化型谷光甘肽）恢复成GSH，即谷胱甘肽循环。故肠道细菌作用于肌酐的代谢产物也减少了GSH的生成。血红蛋白被氧化可形成海因小体，海因小体沉积于红细胞膜，也可使红细胞膜僵硬，易溶血。
本研究结果提示肠道细菌作用于肌酐的分解产物通过多环节损害红细胞的正常结构与功能，是造成尿毒症性贫血的重要物质，补充GSH对红细胞的损害有改善，为临床治疗尿毒症贫血提供了新的启示,临床上将GSH与促红素联用提高尿毒症患者的血红蛋白浓度明显优于单用促红素[7、8]。同时应提出的是肌酐分解产物对红细胞的毒性作用比肌酐更大，提示尿毒症毒素分解酶的研究应注意下限物质的毒性。
参考文献
[1] 胡白瑛，蒋云生.尿毒症患者与正常人肠道细菌利用肌酐的研究.中国医师杂志.2004;6（2）:160-162
[2] Conklin DJ ,Cowley HR, Wiechmann RJ,et al. Vasoactive effects of methylamine in isolated human blood vessels: role of semicarbazide-sensitive amine oxidase, formaldehyde, and hydrogen peroxide. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2004; 286: H667-H676
[3] Conklin DJ， Langford SD， Boor PJ，et al. Contribution of serum and cellular semicarbazide-sensitive amine oxidase to amine metabolism and cardiovascular toxicity. Toxicological Sciences. 1998; 46:386-392
[4] Andrés N,Lizcano JM, Manuel J，et al. Tissue Activity and Cellular Localization of Human Semicarbazide-sensitive Amine Oxidase. J Histochem. Cytochem.2001;49:209-218
[5] Ienaga K,Nakamura K,Fukunaga Y,et al.Creatol and chronic renal failure.Kidney International 1994;46（S）:22-24
[6] 張新，彭立人，孟娟.血液透析患者氧化应激相关影响因素分析.山东医药.2006;46（11）:43-44
[7] 张忠，刘军.还原型谷胱甘肽治疗尿毒症贫血疗效观察.吉林医学.2010;31（1）:66-67
[8] 李素珍. 还原型谷胱甘肽对尿毒症红细胞寿命的影响.中国实用医刊.2008;35（18）:31-32
【关键词】肌酐产物;红细胞;溶血;GSH
【中图分类号】R331.1【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2011）08-0385-03
The effection and mechanismthat products metabolism of creatinine treated erythrocytes
Hu Baiying
【Abstract】Objective: To study the toxicity that metabolite of creatinine treatederythrocytes.Methods：Metabolist of creatinine of uraemia intestinal bacteria was confirmed by HPLC. Klebsiella pneumoniae were incubated with creatinine, it’s metabolite and erythrocytes were incubated. hemolysiswas observed and GSH was determined in erythrocytes.Results：Metabolist of creatinine was methylamine, which can bring hemolysis of erythrocytes（P<0.05）. Degree of hemolysis of creatinine group was 1.52% and that of metabolist of creatinine group was 3.52%. Added up glucose and ATP, the hemolysis was not reversed. Added up GSH, it was reversed （P<0.01）. Concentration of GSH in erythrocytes of metabolist of creatinine group was decreased （P<0.001）. Concentration of GSH of creatinine group was 2152.98μmol/L and that of metabolist of creatinine group was 1047.49μmol/L. Conclusions：The toxicity to erythrocytes of the metabolite of creatinine is stronger than that of creatinine. The toxicity could be reversed by GSH.
【Key words】ErythrocytesGSHMetabolite of creatinine
慢性腎衰酶疗法，不仅要研究酶的结构、功能，最大限度发挥其分解作用，但对分解后的产物对人体的作用的研究也是至关重要的。毒素分解的下限物质必须是无毒的，对人体组织细胞安全。因而研究产物的毒性作用，是关系酶疗法的重要内容。国内对该领域报道较少，该部分则探讨肌酐产物对红细胞的影响。
1 材料
（1）利用肌酐能力最强的尿毒症患者的肠道细菌——肺炎克雷伯菌（实验已另文发表）。
（2）肌酐。
（3）正常健康志愿者的红细胞。
2 方法
2.1 肌酐产物的分析:肌酐对照液的配制：肌酐，用双蒸水配制成0.14mg/ml。
肌酐转化为甲基胍的对照液配制：肌酐230 mg，三氯化铁270 mg，1%过氧化氢100 ml，于震荡恒温培养箱，25℃温育3小时，即得。其为肌酐、甲基胍及中间代谢产物。
肠道细菌作用于肌酐的代谢产物的配制：肌酐1200μmol/ml溶液1ml，肠道细菌1菌环，37℃恒温培养箱培养48小时，离心取上清液。
细菌将肌酐转化为甲胺的对照液配制：取分解肌酐为甲胺的土壤细菌斯氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）一菌环，余操作同3。
色谱图制作用微量移液器加样品于液相色谱反向Devolosil ODS-5？m柱（4.6*150mm），0.1%三氟乙酸作为洗脱液，于色谱仪中缓慢洗脱。之前，需用同一洗脱液平衡色谱仪。
2.2 溶液配置
A液：含有1200μmol/L肌酐的无蛋白培养基。
B液：A液1ml，加入利用肌酐能力最强的尿毒症患者的肠道细菌——肺炎克雷伯菌一菌环，放入37℃恒温培养箱培养48h离心取上清液，纠正PH值，微孔滤纸过滤除菌，作为肌酐产物备用。
G液：不含肌酐的无蛋白培养基1 ml，加入肺炎克雷伯菌一菌环，放入37℃恒温培养箱培养48h离心取上清液，纠正PH值，微孔滤纸过滤除菌，作为细菌产物备用。
脱纤维蛋白抗凝血：无菌抽取健康志愿者静脉血100 ml，注入消毒的带玻璃珠的三角烧瓶内适当摇动脱去纤维。
分组：2ml脱纤维蛋白抗凝血基础上每管加入A液0.1ml 为A组；B液0.1ml 为B组；在B液组的基础上加入10%葡萄糖0.1ml为葡萄糖组，加入PH6.8的2.5%的三磷酸腺酐（ATP）0.1ml者为ATP组，加入5mmol/L的还原型谷胱甘肽（GSH）0.1ml者为GSH组。抗凝血加入生理盐水0.1ml 者为正常对照F组，加入G液0.1ml者为G组。
2.3 溶血试验（参照红细胞自身溶血试验设计）：取脱纤维蛋白血1ml分离血清待作空白管用；另1ml置冰箱作溶血管。余血每管取2ml按A、B、葡萄糖、ATP、GSH、F、G 5组，分别进行实验。
37℃温育48h后轻轻将试管混匀，并各取1ml作红细胞压积，另1ml经离心后吸上清液0.5ml于另一管中，并各再加入0.04%氨水4.5ml。
用520nm（绿色）滤光板比色，记录各测定管的光密度。用未温育血清0.5ml，加4.5ml氨水为空白对照管。
溶血管：取未温育全血0.1ml加氨水20ml按上法比色。
计算：溶血度%测定管读数*（100-红细胞压积）/溶血管读数*20
2.4 谷胱甘肽测定：无菌抽取健康志愿者静脉血50ml肝素抗凝。
在每管取2ml抗凝血的基础上，加入0.1 ml生理盐水为生理盐水组；加入A液0.1ml 为A组；B液0.1ml 为B组，G液0.1ml为G组。
各组标本于37℃恒温箱温育48h。
各取0.2ml温育后的血，按《临床血液学检验》中还原型谷胱甘肽的比色法测定。
2.5 统计学处理:实验数据用均数加减标准差（X±S）表示，两均数的比较用t检验，组间差用方差分析，显著性水准取双侧P<0.05。统计软件包用SPSS11.0。
2 结果
2.1 色谱图：
2.2 红细胞溶血情况,见表1。
2.3 红细胞内GSH的含量,见表2。
3 讨论
正常情况下肌酐在肠道的分布不足1%，大部分经肾脏排泄，还有一小部分经呼吸道排泄。尿毒症情况下，肾脏丧失对肌酐的排泄，其在胃肠
表1 实验各组溶血情况
与A液、G液组比较*P<0.05；与B液组比较#P<0.05；**P<0.001。
表2 实验各组培育48h后红细胞内GSH的测定
与A、G组及生理盐水组比较，*P<0.001。
道的排泄明显增加。14C标记的肌酐经肠道细菌代谢，其分解产物吸收入血后还可从呼吸道排泄。因此，尿毒症患者的肠道细菌对肌酐的代谢显的很重要。已有研究证明肠道细菌通过氧化还原反应分解利用肌酐[1]，肠道细菌可以产生肌酐酶。亦有学者发现尿毒症患者大便中肌酐酶的量增加，活性增强。肠内容物与肌酐共同孵育后可测出甲胺。有文献报道肠道细菌作用于肌酐的降解产物为甲胺，即肌酐在肠道细菌分泌的肌酐酶的作用下水解为肌酸，肌酸在经甲基甘氨酸代谢为甲胺。
甲胺的代谢毒性强，对神经系统，脉管系统，视网膜等都有较强的毒性。其吸收入血，在氨基脲敏感的胺氧化酶（SSAO）作用下，形成甲醛、过氧化氢[2]。SSAO广泛存在于血管内皮细胞、肾小管上皮细胞及血浆、血清中[3、4]。代谢过程中生成了氧化物质，消耗了过多的还原物质。
肌酐在哺乳动物体液内的代谢途径：肌酐氧化为氢氧化肌酐，氢氧化肌酐再水解为甲基胍[5]。其中，氢氧化肌酐和甲基胍的毒性均较肌酐强。肌酐是体内的一种还原物质，它能清除羟基自由基，其代谢产物毒性又强，所以说尿毒症患者体内的肌酐是一柄双刃剑。前述反应中，第一步为非酶促的氧化反应。只要有羟基自由基均可能发生反应。患者体内的细菌对肌酐的代谢是否还可遵循上述途径产生甲基胍？
为了进行证实，我们用液相色谱仪对细菌代谢产物进行分析，结果肠道细菌分解肌酐的图谱与分解肌酐为甲胺的土壤细菌的图谱一致。与转化成甲基胍的对照图不一致。所以尿毒症患者肠道细菌对肌酐的代谢与肌酐在哺乳动物体液的代谢不同，其代谢产物为甲胺。
尿毒症患者体内氧化应激增加。氧化应激程度可以用氢氧化肌酐和甲胺水平来衡量。从实验中我们可以看出，加入肌酐产物组溶血明显高于单纯肌酐组和单纯细菌产物组（P<0.05）。说明肌酐产物组的毒性较强。为寻求缓解红细胞破坏的因素，我们分别往代谢产物组加入葡萄糖，ATP，GSH。葡萄糖组溶血不但不纠正，反而比原来加重（P<0.05），ATP组溶血未能纠正，有加重趋势，但无统计学意义，与原产物组比较 P>0.05 。GSH组溶血明显纠正（P<0.001）。这就说明肌酐产物组消耗了过多的GSH，或抑制了GSH的生成。为了证实这个推测，我们进行了红细胞内的GSH测定。肌酐产物组明显降低，与单纯肌酐组，单纯细菌产物组及正常组比较P<0.001。这说明肌酐产物组的氧化性强，肠道细菌在代谢肌酐的过程中，代谢产物作用于红细胞的过程中的氧化物质和反应性氧类消耗了GSH或减少了GSH的生成。所以我们说肌酐产物组毒性更强。它可以使红细胞膜上的脂质过氧化。
慢性肾功能不全贫血的主要原因是促红细胞生成素的减少和红细胞寿命的缩短。许多作者还认为脂质过氧化也是红细胞溶血的重要原因。近年来大量文献报道慢性肾功能衰竭患者体内抗氧化能力减弱，反应性氧类（包括超氧阴离子、过氧化物和自由基）产生异常增多，氧化应激增强[6]。脂质过氧化反应增强。反应性氧类可攻击细胞膜不饱和脂肪酸形成脂质过氧化物。红细胞膜是磷脂双分子层结构，有膜蛋白嵌于其中，即液态镶嵌模型。磷脂均为不饱和脂肪酸，甲醛、过氧化氢等与之反应，产生过氧化脂质，过氧化脂质再氧化不饱和脂肪酸，形成瀑布效应，最终产生丙二醛。甲醛、丙二醛都含有醛基，醛基可作用于膜磷脂中的磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸的氨基，形成新的磷脂酰成分，进而影响脂质和蛋白质相互作用，导致膜结构和功能的异常。反应性氧类，醛基使膜蛋白上的巯基氧化，膜蛋白功能受损。GSH可以中断这些氧化反应。GSH是氧化物质清除剂，它可以与活性氧反应，清除自由基，使二者介导的氧化反应不进行，切断其瀑布效应。GSH含有巯基，该巯基在氧化的环境中首先与氧化物质结合，转变成氧化型谷胱甘肽，使磷脂、膜蛋白免受氧化损伤，所以不在出现溶血。此外,还原型谷胱甘肽的细胞保护作用还与其降解产物甘氨酸有关，甘氨酸具有强大的稳定细胞膜的功能。
因为GSH提供还原性巯基，使含巯基的酶和蛋白质巯基稳定。细胞内各重要代谢通路许多关键酶为含巯基的酶，或以巯基为活性中心，酶的活性对巯基的变化十分敏感。利用这个原理可解释为什么肌酐产物组加入葡萄糖、ATP溶血不纠正。因为红细胞膜上存在转运葡萄糖的特异性载体，即葡萄糖转运子。红细胞经其摄取葡萄糖。这些载体往往是些膜蛋白，这些膜蛋白被氧化失去转运葡萄糖的功能，即红细胞在这种条件下存葡萄糖利用障碍。加入葡萄糖只能使糖升高，高糖时葡萄糖转运子亦下调，NA+-k+-ATP酶的活性明顯降低，故溶血明显加重。
红细胞内NA+-k+-ATP酶又称钠泵，其作用是维持细胞内外阳离子的平衡，当细胞内钠离子增多或钾离子减少时，都会激活钠泵，把钠离子排出细胞外，把钾离子吸入细胞内，阳离子的主动转运需要ATP提供能量。NA+-k+-ATP酶也是蛋白酶，在肌酐产物组，酶蛋白被氧化，加入的ATP无法利用，故溶血不能纠正。同理，加入GSH后，钠泵不被氧化，不存在ATP利用障碍，溶血纠正。
红细胞中还存在着6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶、己糖激酶、GSH-PX（谷胱甘肽过氧化物酶）、SOD（超氧化物歧化酶）等酶类和血红蛋白等物质。这些酶类和血红蛋白都可不同程度的被氧化。氧化物质存在多，氧化性强，氧化损伤就重；氧化物质存在少，氧化性弱，氧化损伤就轻。氧化程度的轻重直接影响了其功能。
上述酶类氧化，会出现葡萄糖、能量利用障碍，磷酸戊糖旁路受抑。磷酸戊糖旁路产生NADPH（还原型辅酶II）。由于人红细胞没有细胞核，磷酸戊糖途径的最终产物NADPH不可能用于核苷酸合成，只能用于维持细胞膜上GSH的还原状态。GSH是较敏感的并能反映组织细胞抗损伤能力及受损程度的观察指标。当血液中氧化物质增加时，红细胞将需要更多的NADPH用于被GSSG（氧化型谷光甘肽）恢复成GSH，即谷胱甘肽循环。故肠道细菌作用于肌酐的代谢产物也减少了GSH的生成。血红蛋白被氧化可形成海因小体，海因小体沉积于红细胞膜，也可使红细胞膜僵硬，易溶血。
本研究结果提示肠道细菌作用于肌酐的分解产物通过多环节损害红细胞的正常结构与功能，是造成尿毒症性贫血的重要物质，补充GSH对红细胞的损害有改善，为临床治疗尿毒症贫血提供了新的启示,临床上将GSH与促红素联用提高尿毒症患者的血红蛋白浓度明显优于单用促红素[7、8]。同时应提出的是肌酐分解产物对红细胞的毒性作用比肌酐更大，提示尿毒症毒素分解酶的研究应注意下限物质的毒性。
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