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摘 要 糯米香是原产自云南的稀有的爵床科草本植物，因其散发出印度香米和班兰叶的香味而闻名。采用顶空固相微萃取技术（HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用技术调查海南产糯米香叶的挥发性成分，通过优化HS-SPME进样条件得出最佳萃取条件。结果表明：最佳萃取条件为：1 g糯米香叶干粉，NaCl添加量为2 g，萃取头为DVB/CAR/PDMS，平衡时间为30 min，萃取温度为70 ℃，萃取时间为30 min。从糯米香叶中分离出79种挥发性成分，其中2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶是糯米香叶的主要挥发性成分，分别占总挥发性物质的43.89%和37.06%；其次为哌啶-2-甲酸乙酯（5.88%）、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶（5.27%）和丙酰基吡啶（1.73%）；微量成分为1-烯基-3-庚酮、3-辛酮、3-辛醇、乙酰基吡啶和2-乙酰基哌啶。
关键词 糯米香叶；顶空固香微萃取技术；四氢吡啶；香气成分
中图分类号 TQ65，O657 文献标识码 A
Abstract Strobilanthes tonkinensis originated from Yunnan province is a rare acanthaceae plant. It is known as spice with a strong odor reminiscent of basmati rice or pandan leaves. Volatiles in Strobilanthes tonkinensis leaves were investigated by headspace solid phase microextraction（HS-SPME）. The HS-SPME technique was previously evaluated to optimize the sampling conditions. The best sampling conditions were one kilogram of Strobilanthes tonkinensis were mixed with two kilograms of NaCl. The DVB/CAR/PDMS was chosen as SPME fiber. The balance time，extraction temperature，extraction time were set as 30 min，70 ℃，30 min，respectively. Strobilanthes tonkinensis leaves contained 79 kinds of volatiles，in which 1-（3，4，5，6-tetrahydro-2-pyridyl）-1-propanone （43.89%）and 1-（1，4，5，6-tetrahydro-2-pyridyl）-1-propanone（37.06%）constituted the main part of the volatile compounds. Minor components were ethyl pipecolinate（5.88%）， 2-Acetyl-3，4，5，6-tetrahydropyridine（5.27%）， 1-Propanone， 1-（2-pyridinyl）-（1.73%）， 1-Hepten-3-one，3-Octanone，3-Octanol，1-（2-pyridinyl）-ethanone， and 2-Acetylpiperidine in trace amounts，repectively.
Key words Strobilanthes tonkinensis leaves；Headspace solid phase microextraction；Tetrahydropyridines；Volatiles
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.027
糯米香为爵床科（Acanthaceae）马蓝属（Strobil-
anthes）多年生草本植物，学名Strobilanthes tonkinensis Lindau，将S. menglaensis作为异名处理，原产于云南景洪、临沧等地，生于低山沟谷密林下或石灰岩山脚密林下，泰国和越南也有分布[1-2]。因其叶片散发出淡淡的糯米香味而命名。据植物志编委会[2]和谭乐和等[3]报道，糯米香是一种天然香料和药用植物，全株含有40多种香气成分和对人体有益的氨基酸，用糯米香叶片制成的茶称为糯米香茶，是一种名贵的天然保健茶。除可供调配香精，其亦可作为茶叶、酒曲、饼干、冰淇淋、点心等的配料，其香气清雅，滋味醇正爽口，植株干时散发出独特的糯米香气，具有清热解毒、养颜抗衰等功效。另据潘玉梅[4]报道，糯米香茶是一种天然饮料，是云南傣家待客的常用饮料。
近年来关于糯米香叶的研究主要集中于采用不同提取方法对糯米香叶风味及风味组分影响的初步研究。Naef等[5]用正己烷萃取云南产糯米香叶的香气成分并用气质联用和核磁共振技术分析糯米香叶挥发性成分；Yin等[6]用乙醇提取海南产糯米香叶中的香气成分并研究其有效成分的生物活性；谭乐和等[3]采用超临界CO2萃取结合气质联用技术分析海南产糯米香叶中的挥发油组分和含量；李维莉等[7]采用同时蒸馏萃取结合气相色谱-质谱联用仪研究了云南产糯米香叶的香气组分和含量。针对海南产糯米香叶的香气成分分析少有报道，特别是关于采用固相微萃取技术研究海南产糯米香叶尚未见报道，考察海南产糯米香叶香气成分可为海南地区糯米香叶的产品研发、产品加工等提供理论依据。
固相微萃取作为一种新型的萃取手段，集无有机溶剂、需样品量少和操作简便等优点，被广泛应用于多种水果和茶的香味成分分析[8]。本研究以海南产糯米香叶为原材料，采用固相微萃取技术捕集其中的香气成分，结合气相色谱-质谱联用技术对其香气成分进行鉴定，分析海南地区糯米香叶的挥发性香气成分，为海南产糯米香的香气品质分析、产品加工及遗传育种等提供理论参考。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物 糯米香叶采自兴隆热带植物园，采集时间为2013年5月，叶片经阴干、粉碎、过60目筛后备用；氯化钠为分析纯；正构烷烃混合标准品（C7-C30）购自美国Sigma公司。
1.1.2 仪器与设备 DS-1高速组织破碎机（上海标本模型厂）；中科美菱医用低温箱（中科美菱低温科技有限责任公司）；Thermo Trace1300-ISQ气相色谱-质谱联用仪[配有离子源（EI）及Xcalibur数据处理系统]（美国Thermo公司）；TRIPLUS RSH自动进样器、20 mL样品瓶（美国Thermo公司）；固相微萃取自动进样手柄（美国Thermo公司）；固相微萃取头（100 μm PDMS，65 μm PDMS/DVB，75 μm CAR/PDMS，50/30 μm DVB/CAR/PDMS，85 μm PA，7 μm PDMS）（美国Supelco公司）。
1.2 方法
1.2.1 萃取头老化 将6种不同极性固相微萃取头置于气相色谱仪进样口中老化，不同萃取头老化时间及温度见表1。
1.2.2 萃取条件选择 （1）萃取头：在预试验的基础上，固定糯米香叶为1 g，样品瓶为20 mL，平衡时间为10 min，萃取温度为50 ℃，萃取时间为40 min，分别考察已老化好的不同萃取头种类 （PDMS、CAR/PDMS、PDMS/DVB、DVB/CAR/PDMS、PA）萃取效果，解析条件为气质联用仪，进样口温度为250 ℃，解析5 min，每组3个平行。（2）平衡时间：在萃取头的基础上，考察不同平衡时间（5、10、20、30、40 min）的萃取效果，其余条件同上，每组重复3次。 （3）萃取温度： 在萃取头、 平衡时间的基础上，考察不同萃取温度（40 、 50 、60、70、 80 ℃）的萃取效果， 其余条件同上， 每组重复三次 （4）萃取时间：在萃取头、平衡时间的基础上，考察不同萃取时间（20、30、40、50、60 min）的萃取效果，其余条件同上，每组重复3次。（5）NaCl添加量：在萃取头选择的基础上，考察不同NaCl添加量（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g）萃取的效果，其余条件同上。每组重复3次。
1.2.3 气质联用分析 经预试验确定色谱柱分析条件如下：Thermo TR-5MS弹性石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始柱温为40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的升温速度升至150 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至280 ℃，保持4 min；载气（He）流速1.0 mL/min；进样量为1 μL，进样口温度为250 ℃。
质谱条件：电子轰击（EI） 离子源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度250 ℃；质量扫描范围m/z 30～450。
采用相同的气相色谱条件测定正构烷烃（C7-C30）在TR-5MS弹性毛细管柱上的保留时间，利用正构烷烃的保留时间可以计算出糯米香叶中各挥发性化合物的相对保留时间。
1.3 数据处理
试验数据处理由Xcalibur系统软件完成：将挥发性物质与NISTOS标准谱库检索结果对比；将挥发性物质的相对保留时间与文献报道的数据进行对比，采用面积归一法计算糯米香叶中各挥发性成分的相对含量，以峰面积表示香气成分的含量。试验数据分析由SPSS13.0完成，采用最小显著性差异（p<0.05）的方法。
2 结果与分析
2.1 萃取头
固定糯米香叶为1 g，样品瓶为20 mL，平衡时间为10 min，萃取温度为50 ℃，萃取时间为40 min，不同萃取头种类（PDMS、CAR/PDMS、PDMS/DVB、DVB/CAR/PDMS、PA）对糯米香叶萃取的效果如表2所示。结果表明，不同极性萃取头吸附糯米香叶挥发性物质的总面积大小顺序分别为DVB/CAR/PDMS>CAR/PDMS>PDMS/DVB>PDMS（100 μm）>PA>PDMS（7 μm），说明萃取头DVB/CAR/PDMS和CAR/PDMS对糯米香叶中挥发性物质提取效果较好。6种萃取头对小分子量化合物醇类、醛类都显示出较高的吸附性，其中DVB/CAR/PDMS、CAR/PDMS和PDMS/DVB对醇类、醛类、酸类、酮类、酯类具有高的吸附性，PDMS/DVB萃取头对醇类和烃类的吸附性最高，很可能是因为CAR具有比表面积大易于吸附小分子化合物的特点；DVB是极性固体涂层，具有大孔径和吸附半挥发性物质的特点；PDMS具有吸附烃类化合物的特点。萃取头DVB/CAR/PDMS同时具备3种萃取头的特点，因此吸附的总挥发性化合物最高。综合以上分析，本研究选取DVB/CAR/PDMS萃取头提取糯米香叶中挥发性成分。
2.2 平衡时间
平衡时间为糯米香叶的挥发性成分在气相中达到平衡所需要的时间。根据2.1的试验结果，糯米香叶中含有最主要的4种挥发性成分：2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶，2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶，哌啶-2-甲酸乙酯，2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶。不同平衡时间对呈香物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量的影响结果如图1-A所示。结果表明，低分子量挥发性物质是糯米香叶中的主要组分，特别是2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶，两者之和超过70%；而高分子量挥发性物质含量较低。随平衡时间由5 min增加到30 min，低分子量挥发性物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶均呈现增加趋势，当时间增加到40 min时，低分子量挥发性物质含量显著下降（p<0.05），总挥发性物质增加不显著（p<0.05），而2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量均显著降低（p<0.05），因此本试验选取平衡时间为30 min。 2.3 萃取温度
根据2.1和2.2的结果，不同萃取温度对低分子量挥发物、高分子量挥发性物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量的影响结果如图1-B所示。结果表明，随萃取温度的从40 ℃升高到70 ℃，萃取头DVB/CAR/PDMS显著提高2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶的含量（p<0.05）；此外，温度的升高导致低分子量挥发性物质和总挥发性物质含量显著增加（p<0.05）；但当温度升高到80 ℃，低分子量挥发物、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量均显著降低（p<0.05），而高分子量挥发性物质显著增加（p<0.05）。本试验选取萃取温度为70 ℃。
2.4 萃取时间
根据2.1、2.2和2.3的结果，不同萃取时间对低分子量挥发物、高分子量挥发性物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量的影响结果如图1-C所示。结果表明，随萃取时间的从20 min增加到50 min，低分子量挥发物、高分子量挥发性物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量均增加，但差异并不显著（p<0.05）；当萃取时间超过50 min时，所有挥发性物质含量均降低。各种挥发性物质的理化特性决定了它们在萃取头-气相和样品溶液-气相中的分配系数，当萃取时间达到50 min时，高低分子量、总挥发性物质及4种主要挥发性成分均达到较高值，因此本试验选取萃取时间为50 min。
2.5 氯化钠添加量
根据2.1、2.2、2.3和2.4的结果，不同NaCl添加量对低分子量挥发物、高分子量挥发性物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量的影响结果如图1-D所示。结果表明，未添加NaCl时，低分子量挥发物、高分子量挥发性物质和总挥发性物质含量分别为3.04E+10、3.03E+9和3.35E+10；当添加量为0.5 g时，低分子量挥发物、高分子量挥发性物质和总挥发性物质分别降为2.89E+10、1.70E+9和3.06E+10；随着NaCl添加量继续增加至2 g时，低分子量挥发物、高分子量挥发性物质、总挥发性物质含量均显著增加（p<0.05），达到3.51E+10、3.26E+9和3.60E+10。当NaCl添加量从0增加至2 g，2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量均显著增加（p<0.05）；但当添加量继续增加至2.5 g和3.0 g时，所有挥发性物质含量均显著降低（p<0.05）。因此本试验中选取最佳NaCl添加量为2.0 g。
2.6 顶空-固相微萃取法萃取的糯米香叶挥发性成分分析
根据前面的单因素试验，将最佳顶空-固相微萃取条件设定为：称取1 g糯米香叶干粉于20 mL顶空瓶中，添加2 g NaCl，加入4 mL水，混合均匀，采用萃取头DVB/CAR/PDMS，平衡时间为30 min，萃取温度为70 ℃，萃取时间为50 min。采用此条件萃取糯米香叶中的挥发性成分，并利用气相色谱-质谱法分离鉴定其中的挥发性成分，结果如表3所示。结果表明，从糯米香叶中共分离出79种挥发性成分，其中包含有12种醇类、2种醛类、15种烃类、16种酮类、5种酸类、7种酯类、14种芳香族类和8种其它类化合物，分别占总挥发性物质含量的0.62%、0.07%、1.10%、87.37%、0.76%、5.99%、3.16%和0.72%，酮类是其主要成分，其次为酯类、芳香族类、烃类、酸类、其它类、醇类、醛类。由表3可知，2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶是糯米香叶的主要挥发性成分，分别占总挥发性物质的43.89%和37.06%，二者之和达到80.95%；其次为哌啶-2-甲酸乙酯、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和丙酰基吡啶，其相对含量分别为5.88%、5.27%和1.73%；微量成分为1-烯基-3-庚酮、3-辛酮、3-辛醇、乙酰基吡啶和2-乙酰基哌啶。
3 讨论与结论
据Achouri等[9]报道，不同萃取头有不同的性质，萃取头吸附挥发性化合物是根据相似相容原理进行的，CAR具有比表面积大易于吸附小分子化合物的特点，DVB是极性固体涂层，具有大孔径和能够吸附半挥发性物质的特点，PA为极性萃取头，容易吸附极性或半挥发性化合物；PDMS是非极性萃取头，适合吸附含有碳氢的化合物如烃类；PDMS/DVB是中极性萃取头，适合吸附双极性化合物如醇类、醛类、酮类等；CAR/PDMS是中极性萃取头，适合吸附小分子化合物；萃取头DVB/CAR/PDMS同时具备3种萃取头的特点，也为中极性萃取头，对混合极性和非极性化合物具有较好的吸附性，如酮类、酯类、酸类、醇类等混合挥发性物质[8]。本研究结果表明，糯米香叶中含有较高含量的酮类、酯类、酸类和醇类，因此萃取头DVB/CAR/PDMS吸附的总挥发性化合物最高，是本研究中的最佳萃取头，这与Lee等[10]报道的结果一致。据Lin等[11]报道，溪黄草叶选用CAR/PDMS为最佳萃取头，原因是溪黄草叶含有较高含量的醇类、醛类、烃类及芳香族类化合物，该报道与本试验结果不同的另一个原因是由于不同物质所含挥发性化合物成分含量和种类不同所引起。 此外，根据Lin等[11]报道，分子量在200以上的归为高分子量挥发性物质，分子量在200以下归为低分子量挥发性物质，本研究主要考察不同萃取条件对呈香物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量的影响。根据Ezquerro等[12]报道，温度会影响挥发性物质在萃取头上的扩散速率，当温度升高时，挥发性物质从溶液中逸散至气相的速率增加，其在气相中的浓度提高，但当温度过高时，反而会降低挥发性物质的分配系数，从而导致萃取头对挥发性物质的吸附能力降低。因此，本研究选取萃取温度为70 ℃。据Lee等报道[10]，NaCl的添加利于挥发性成分逸出，特别是利于小分子化合物的挥发，但当NaCl添加量过高时反而会降低萃取效果，本研究中选取最佳NaCl添加量为2.0 g。据Lin等[11]报道，顶空固相微萃取方法可以最大程度地吸附物质中的低分子量挥发性成分，更好地保留叶片的香气成分，本研究结果与Lin等[11]报道相吻合。
糯米香叶因闻起来有种印度香米、面包和爆米花的味道而闻名。根据报道，最初猜测这种味道是作为蒸米饭和班兰叶的主要成分且分子量为125的2-乙酰基-1-二氢化吡咯所引起[13-14]。但本研究经质谱检测发现其主要成分是分子量为139的2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶，这一结果与Naef等[5]报道的结果相一致，其通过核磁共振光谱鉴定云南产糯米香叶的主要香气成分为2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶。De Kimpe等[15]和Hofmann等[16]通过合成2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶和通过在美拉德反应模型中制备2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶而充分了解两者的特点，并建立二者的感官特点（如爆米花和烧烤的味道），其在空气中的阈值为0.2 ng/L。Naef等[5]表明云南产糯米香叶主要成分为2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶，其含量分别为41.2%和37.5%，二者之和为78.7%；次要成分为2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-乙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶、1-（2-哌啶基）-1-丙酮、1-辛烯-3-醇和1-辛烯-3-酮，其含量分别为4.9%、4.8%、5.2%、3.2%和1.9%。本研究中2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶是糯米香叶的主要挥发性成分，分别占总挥发性物质的43.89%和37.06%，二者之和达到80.95%；其次为哌啶-2-甲酸乙酯、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和丙酰基吡啶，含量分别为5.88%、5.27%和1.73%，微量成分为1-烯基-3-庚酮、3-辛酮、3-辛醇、乙酰基吡啶和2-乙酰基哌啶。经对比可发现，无论云南产还是海南产糯米香叶，其糯米香气主要是由2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶引起，而二者的地域差异导致糯米香气次要挥发性成分的差异。综上所述，本研究结果为海南产糯米香叶的研发提供了一定的理论依据。
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关键词 糯米香叶；顶空固香微萃取技术；四氢吡啶；香气成分
中图分类号 TQ65，O657 文献标识码 A
Abstract Strobilanthes tonkinensis originated from Yunnan province is a rare acanthaceae plant. It is known as spice with a strong odor reminiscent of basmati rice or pandan leaves. Volatiles in Strobilanthes tonkinensis leaves were investigated by headspace solid phase microextraction（HS-SPME）. The HS-SPME technique was previously evaluated to optimize the sampling conditions. The best sampling conditions were one kilogram of Strobilanthes tonkinensis were mixed with two kilograms of NaCl. The DVB/CAR/PDMS was chosen as SPME fiber. The balance time，extraction temperature，extraction time were set as 30 min，70 ℃，30 min，respectively. Strobilanthes tonkinensis leaves contained 79 kinds of volatiles，in which 1-（3，4，5，6-tetrahydro-2-pyridyl）-1-propanone （43.89%）and 1-（1，4，5，6-tetrahydro-2-pyridyl）-1-propanone（37.06%）constituted the main part of the volatile compounds. Minor components were ethyl pipecolinate（5.88%）， 2-Acetyl-3，4，5，6-tetrahydropyridine（5.27%）， 1-Propanone， 1-（2-pyridinyl）-（1.73%）， 1-Hepten-3-one，3-Octanone，3-Octanol，1-（2-pyridinyl）-ethanone， and 2-Acetylpiperidine in trace amounts，repectively.
Key words Strobilanthes tonkinensis leaves；Headspace solid phase microextraction；Tetrahydropyridines；Volatiles
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.027
糯米香为爵床科（Acanthaceae）马蓝属（Strobil-
anthes）多年生草本植物，学名Strobilanthes tonkinensis Lindau，将S. menglaensis作为异名处理，原产于云南景洪、临沧等地，生于低山沟谷密林下或石灰岩山脚密林下，泰国和越南也有分布[1-2]。因其叶片散发出淡淡的糯米香味而命名。据植物志编委会[2]和谭乐和等[3]报道，糯米香是一种天然香料和药用植物，全株含有40多种香气成分和对人体有益的氨基酸，用糯米香叶片制成的茶称为糯米香茶，是一种名贵的天然保健茶。除可供调配香精，其亦可作为茶叶、酒曲、饼干、冰淇淋、点心等的配料，其香气清雅，滋味醇正爽口，植株干时散发出独特的糯米香气，具有清热解毒、养颜抗衰等功效。另据潘玉梅[4]报道，糯米香茶是一种天然饮料，是云南傣家待客的常用饮料。
近年来关于糯米香叶的研究主要集中于采用不同提取方法对糯米香叶风味及风味组分影响的初步研究。Naef等[5]用正己烷萃取云南产糯米香叶的香气成分并用气质联用和核磁共振技术分析糯米香叶挥发性成分；Yin等[6]用乙醇提取海南产糯米香叶中的香气成分并研究其有效成分的生物活性；谭乐和等[3]采用超临界CO2萃取结合气质联用技术分析海南产糯米香叶中的挥发油组分和含量；李维莉等[7]采用同时蒸馏萃取结合气相色谱-质谱联用仪研究了云南产糯米香叶的香气组分和含量。针对海南产糯米香叶的香气成分分析少有报道，特别是关于采用固相微萃取技术研究海南产糯米香叶尚未见报道，考察海南产糯米香叶香气成分可为海南地区糯米香叶的产品研发、产品加工等提供理论依据。
固相微萃取作为一种新型的萃取手段，集无有机溶剂、需样品量少和操作简便等优点，被广泛应用于多种水果和茶的香味成分分析[8]。本研究以海南产糯米香叶为原材料，采用固相微萃取技术捕集其中的香气成分，结合气相色谱-质谱联用技术对其香气成分进行鉴定，分析海南地区糯米香叶的挥发性香气成分，为海南产糯米香的香气品质分析、产品加工及遗传育种等提供理论参考。 1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物 糯米香叶采自兴隆热带植物园，采集时间为2013年5月，叶片经阴干、粉碎、过60目筛后备用；氯化钠为分析纯；正构烷烃混合标准品（C7-C30）购自美国Sigma公司。
1.1.2 仪器与设备 DS-1高速组织破碎机（上海标本模型厂）；中科美菱医用低温箱（中科美菱低温科技有限责任公司）；Thermo Trace1300-ISQ气相色谱-质谱联用仪[配有离子源（EI）及Xcalibur数据处理系统]（美国Thermo公司）；TRIPLUS RSH自动进样器、20 mL样品瓶（美国Thermo公司）；固相微萃取自动进样手柄（美国Thermo公司）；固相微萃取头（100 μm PDMS，65 μm PDMS/DVB，75 μm CAR/PDMS，50/30 μm DVB/CAR/PDMS，85 μm PA，7 μm PDMS）（美国Supelco公司）。
1.2 方法
1.2.1 萃取头老化 将6种不同极性固相微萃取头置于气相色谱仪进样口中老化，不同萃取头老化时间及温度见表1。
1.2.2 萃取条件选择 （1）萃取头：在预试验的基础上，固定糯米香叶为1 g，样品瓶为20 mL，平衡时间为10 min，萃取温度为50 ℃，萃取时间为40 min，分别考察已老化好的不同萃取头种类 （PDMS、CAR/PDMS、PDMS/DVB、DVB/CAR/PDMS、PA）萃取效果，解析条件为气质联用仪，进样口温度为250 ℃，解析5 min，每组3个平行。（2）平衡时间：在萃取头的基础上，考察不同平衡时间（5、10、20、30、40 min）的萃取效果，其余条件同上，每组重复3次。 （3）萃取温度： 在萃取头、 平衡时间的基础上，考察不同萃取温度（40 、 50 、60、70、 80 ℃）的萃取效果， 其余条件同上， 每组重复三次 （4）萃取时间：在萃取头、平衡时间的基础上，考察不同萃取时间（20、30、40、50、60 min）的萃取效果，其余条件同上，每组重复3次。（5）NaCl添加量：在萃取头选择的基础上，考察不同NaCl添加量（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g）萃取的效果，其余条件同上。每组重复3次。
1.2.3 气质联用分析 经预试验确定色谱柱分析条件如下：Thermo TR-5MS弹性石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：初始柱温为40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min的升温速度升至150 ℃，保持1 min，以5 ℃/min升至280 ℃，保持4 min；载气（He）流速1.0 mL/min；进样量为1 μL，进样口温度为250 ℃。
质谱条件：电子轰击（EI） 离子源；电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度250 ℃；质量扫描范围m/z 30～450。
采用相同的气相色谱条件测定正构烷烃（C7-C30）在TR-5MS弹性毛细管柱上的保留时间，利用正构烷烃的保留时间可以计算出糯米香叶中各挥发性化合物的相对保留时间。
1.3 数据处理
试验数据处理由Xcalibur系统软件完成：将挥发性物质与NISTOS标准谱库检索结果对比；将挥发性物质的相对保留时间与文献报道的数据进行对比，采用面积归一法计算糯米香叶中各挥发性成分的相对含量，以峰面积表示香气成分的含量。试验数据分析由SPSS13.0完成，采用最小显著性差异（p<0.05）的方法。
2 结果与分析
2.1 萃取头
固定糯米香叶为1 g，样品瓶为20 mL，平衡时间为10 min，萃取温度为50 ℃，萃取时间为40 min，不同萃取头种类（PDMS、CAR/PDMS、PDMS/DVB、DVB/CAR/PDMS、PA）对糯米香叶萃取的效果如表2所示。结果表明，不同极性萃取头吸附糯米香叶挥发性物质的总面积大小顺序分别为DVB/CAR/PDMS>CAR/PDMS>PDMS/DVB>PDMS（100 μm）>PA>PDMS（7 μm），说明萃取头DVB/CAR/PDMS和CAR/PDMS对糯米香叶中挥发性物质提取效果较好。6种萃取头对小分子量化合物醇类、醛类都显示出较高的吸附性，其中DVB/CAR/PDMS、CAR/PDMS和PDMS/DVB对醇类、醛类、酸类、酮类、酯类具有高的吸附性，PDMS/DVB萃取头对醇类和烃类的吸附性最高，很可能是因为CAR具有比表面积大易于吸附小分子化合物的特点；DVB是极性固体涂层，具有大孔径和吸附半挥发性物质的特点；PDMS具有吸附烃类化合物的特点。萃取头DVB/CAR/PDMS同时具备3种萃取头的特点，因此吸附的总挥发性化合物最高。综合以上分析，本研究选取DVB/CAR/PDMS萃取头提取糯米香叶中挥发性成分。
2.2 平衡时间
平衡时间为糯米香叶的挥发性成分在气相中达到平衡所需要的时间。根据2.1的试验结果，糯米香叶中含有最主要的4种挥发性成分：2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶，2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶，哌啶-2-甲酸乙酯，2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶。不同平衡时间对呈香物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量的影响结果如图1-A所示。结果表明，低分子量挥发性物质是糯米香叶中的主要组分，特别是2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶，两者之和超过70%；而高分子量挥发性物质含量较低。随平衡时间由5 min增加到30 min，低分子量挥发性物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶均呈现增加趋势，当时间增加到40 min时，低分子量挥发性物质含量显著下降（p<0.05），总挥发性物质增加不显著（p<0.05），而2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量均显著降低（p<0.05），因此本试验选取平衡时间为30 min。 2.3 萃取温度
根据2.1和2.2的结果，不同萃取温度对低分子量挥发物、高分子量挥发性物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量的影响结果如图1-B所示。结果表明，随萃取温度的从40 ℃升高到70 ℃，萃取头DVB/CAR/PDMS显著提高2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶的含量（p<0.05）；此外，温度的升高导致低分子量挥发性物质和总挥发性物质含量显著增加（p<0.05）；但当温度升高到80 ℃，低分子量挥发物、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量均显著降低（p<0.05），而高分子量挥发性物质显著增加（p<0.05）。本试验选取萃取温度为70 ℃。
2.4 萃取时间
根据2.1、2.2和2.3的结果，不同萃取时间对低分子量挥发物、高分子量挥发性物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量的影响结果如图1-C所示。结果表明，随萃取时间的从20 min增加到50 min，低分子量挥发物、高分子量挥发性物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量均增加，但差异并不显著（p<0.05）；当萃取时间超过50 min时，所有挥发性物质含量均降低。各种挥发性物质的理化特性决定了它们在萃取头-气相和样品溶液-气相中的分配系数，当萃取时间达到50 min时，高低分子量、总挥发性物质及4种主要挥发性成分均达到较高值，因此本试验选取萃取时间为50 min。
2.5 氯化钠添加量
根据2.1、2.2、2.3和2.4的结果，不同NaCl添加量对低分子量挥发物、高分子量挥发性物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量的影响结果如图1-D所示。结果表明，未添加NaCl时，低分子量挥发物、高分子量挥发性物质和总挥发性物质含量分别为3.04E+10、3.03E+9和3.35E+10；当添加量为0.5 g时，低分子量挥发物、高分子量挥发性物质和总挥发性物质分别降为2.89E+10、1.70E+9和3.06E+10；随着NaCl添加量继续增加至2 g时，低分子量挥发物、高分子量挥发性物质、总挥发性物质含量均显著增加（p<0.05），达到3.51E+10、3.26E+9和3.60E+10。当NaCl添加量从0增加至2 g，2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量均显著增加（p<0.05）；但当添加量继续增加至2.5 g和3.0 g时，所有挥发性物质含量均显著降低（p<0.05）。因此本试验中选取最佳NaCl添加量为2.0 g。
2.6 顶空-固相微萃取法萃取的糯米香叶挥发性成分分析
根据前面的单因素试验，将最佳顶空-固相微萃取条件设定为：称取1 g糯米香叶干粉于20 mL顶空瓶中，添加2 g NaCl，加入4 mL水，混合均匀，采用萃取头DVB/CAR/PDMS，平衡时间为30 min，萃取温度为70 ℃，萃取时间为50 min。采用此条件萃取糯米香叶中的挥发性成分，并利用气相色谱-质谱法分离鉴定其中的挥发性成分，结果如表3所示。结果表明，从糯米香叶中共分离出79种挥发性成分，其中包含有12种醇类、2种醛类、15种烃类、16种酮类、5种酸类、7种酯类、14种芳香族类和8种其它类化合物，分别占总挥发性物质含量的0.62%、0.07%、1.10%、87.37%、0.76%、5.99%、3.16%和0.72%，酮类是其主要成分，其次为酯类、芳香族类、烃类、酸类、其它类、醇类、醛类。由表3可知，2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶是糯米香叶的主要挥发性成分，分别占总挥发性物质的43.89%和37.06%，二者之和达到80.95%；其次为哌啶-2-甲酸乙酯、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和丙酰基吡啶，其相对含量分别为5.88%、5.27%和1.73%；微量成分为1-烯基-3-庚酮、3-辛酮、3-辛醇、乙酰基吡啶和2-乙酰基哌啶。
3 讨论与结论
据Achouri等[9]报道，不同萃取头有不同的性质，萃取头吸附挥发性化合物是根据相似相容原理进行的，CAR具有比表面积大易于吸附小分子化合物的特点，DVB是极性固体涂层，具有大孔径和能够吸附半挥发性物质的特点，PA为极性萃取头，容易吸附极性或半挥发性化合物；PDMS是非极性萃取头，适合吸附含有碳氢的化合物如烃类；PDMS/DVB是中极性萃取头，适合吸附双极性化合物如醇类、醛类、酮类等；CAR/PDMS是中极性萃取头，适合吸附小分子化合物；萃取头DVB/CAR/PDMS同时具备3种萃取头的特点，也为中极性萃取头，对混合极性和非极性化合物具有较好的吸附性，如酮类、酯类、酸类、醇类等混合挥发性物质[8]。本研究结果表明，糯米香叶中含有较高含量的酮类、酯类、酸类和醇类，因此萃取头DVB/CAR/PDMS吸附的总挥发性化合物最高，是本研究中的最佳萃取头，这与Lee等[10]报道的结果一致。据Lin等[11]报道，溪黄草叶选用CAR/PDMS为最佳萃取头，原因是溪黄草叶含有较高含量的醇类、醛类、烃类及芳香族类化合物，该报道与本试验结果不同的另一个原因是由于不同物质所含挥发性化合物成分含量和种类不同所引起。 此外，根据Lin等[11]报道，分子量在200以上的归为高分子量挥发性物质，分子量在200以下归为低分子量挥发性物质，本研究主要考察不同萃取条件对呈香物质、总挥发性物质、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、哌啶-2-甲酸乙酯、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶含量的影响。根据Ezquerro等[12]报道，温度会影响挥发性物质在萃取头上的扩散速率，当温度升高时，挥发性物质从溶液中逸散至气相的速率增加，其在气相中的浓度提高，但当温度过高时，反而会降低挥发性物质的分配系数，从而导致萃取头对挥发性物质的吸附能力降低。因此，本研究选取萃取温度为70 ℃。据Lee等报道[10]，NaCl的添加利于挥发性成分逸出，特别是利于小分子化合物的挥发，但当NaCl添加量过高时反而会降低萃取效果，本研究中选取最佳NaCl添加量为2.0 g。据Lin等[11]报道，顶空固相微萃取方法可以最大程度地吸附物质中的低分子量挥发性成分，更好地保留叶片的香气成分，本研究结果与Lin等[11]报道相吻合。
糯米香叶因闻起来有种印度香米、面包和爆米花的味道而闻名。根据报道，最初猜测这种味道是作为蒸米饭和班兰叶的主要成分且分子量为125的2-乙酰基-1-二氢化吡咯所引起[13-14]。但本研究经质谱检测发现其主要成分是分子量为139的2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶，这一结果与Naef等[5]报道的结果相一致，其通过核磁共振光谱鉴定云南产糯米香叶的主要香气成分为2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶。De Kimpe等[15]和Hofmann等[16]通过合成2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶和通过在美拉德反应模型中制备2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶而充分了解两者的特点，并建立二者的感官特点（如爆米花和烧烤的味道），其在空气中的阈值为0.2 ng/L。Naef等[5]表明云南产糯米香叶主要成分为2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶，其含量分别为41.2%和37.5%，二者之和为78.7%；次要成分为2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶、2-乙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶、1-（2-哌啶基）-1-丙酮、1-辛烯-3-醇和1-辛烯-3-酮，其含量分别为4.9%、4.8%、5.2%、3.2%和1.9%。本研究中2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶是糯米香叶的主要挥发性成分，分别占总挥发性物质的43.89%和37.06%，二者之和达到80.95%；其次为哌啶-2-甲酸乙酯、2-乙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和丙酰基吡啶，含量分别为5.88%、5.27%和1.73%，微量成分为1-烯基-3-庚酮、3-辛酮、3-辛醇、乙酰基吡啶和2-乙酰基哌啶。经对比可发现，无论云南产还是海南产糯米香叶，其糯米香气主要是由2-丙酰基-3，4，5，6-四氢吡啶和2-丙酰基-1，4，5，6-四氢吡啶引起，而二者的地域差异导致糯米香气次要挥发性成分的差异。综上所述，本研究结果为海南产糯米香叶的研发提供了一定的理论依据。
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