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摘 要 借助现代仪器分析技术对GGM分子结构与表面特征进行表征，以期为其物理改性和应用研究提供基础。结果表明：GGM分子链在3 352、2 930、1 639、1 354、1 230、1 028 cm出现特征吸收峰；β-（1→4）-D-吡喃式葡萄糖基和β-D-吡喃式甘露糖基以1，4甙键连接成主链，α-D-吡喃半乳糖基作为侧链通过1，6甙键连接到主链上；单糖分子为螺旋、折叠、卷绕，单个的多糖分子链中存在侧枝，多个分子链间互相缠绕，链间通过糖单元间不同的连接方式衍生许多环或带有分支的侧链结构，具有高度分枝的化学结构。单链的厚度小于2.8 nm，长度为50 nm～2 μm，宽度为10～40 nm；呈团簇状，小球状外表有线状绒毛。
关键词 云杉半乳葡甘露聚糖；结构表征；仪器分析
中图分类号 S831.5 文献标识码 A
Abstract The molecule structure and surface characteristic of galactoglucomannan（GGM）in spruce were studied with instrumental analysis. The characteristic absorbance peaks were revealed at 3 352 cm、2 930 cm、1 639 cm、1 354 cm、1 230 cm、1 028 cm in the FT-IR spectrum The main chain of GGM is composed of 1，4 glycosidic bond， which were proved as β-（1→4）-D-glucopyranose and mannopyranose. The galactopyranose was the side chain， which was connected to the main chain by 1，6 glycosidic bond. The chain of GGM was not shown as linear but spiral， folding， winding and branch. The multiple branch structure of GGM was composed by variety of saccharide unit， bond and branch. The length and width were range from 50-2 μm and 10-40 nm， the thickness was less than 2.8 nm. The appearance of GGM was like cluster， as the linear velvet on the globe surface.
Key words GGM； Structural characterization； Instrumental analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.017
杉木是我国重要的用材树种，具有生长快、产量高、材质好、用途广和易繁殖等特点[1-3]。目前，研究和开发较多的是杉木树根、树皮、树叶和木材的抽提物，如杉木根精油、杉木叶黄酮类化合物等[4-5]，研究表明，杉木抽提物的功能奇特，广泛应用于各行各业，如紫杉醇用于治疗癌症等[6-7]。
但杉木中还含有其他多种功能成分，如多糖、游离氨基酸、甾体类化合物、脂肪酸和维生素等，其中半纤维素多糖占20%～25%，而半纤维素多糖中含量最高的就是半乳葡甘露聚糖（galactoglucomannan，GGM），约占20%[8]，由β-D-吡喃式葡萄糖基和β-D-吡喃式甘露糖基以1，4甙键连接成主链，α-D-吡喃半乳糖基作为侧链通过1，6甙键连接到主链上。GGM中含有大量的羟基，形成分子间或分子内氢键，使GGM具有一定的流变性、持水性、胶凝性、成模性等特性[9-12]，然而关于GGM分子结构和表面特征的结论至今尚未统一，这是限制其应用的主要因素。目前，国内对云杉GGM的研究较少，无相关的文献报道，国外有部分学者在对云杉GGM进行研究，但主要集中在云杉GGM的理化性质方面，对结构和表面特征研究较少[9-12]。基于此，本研究拟采用红外光谱、核磁共振、原子力显微镜、扫描电子显微镜等近现代先进技术研究GGM的结构和表面特征，为其改性提供理论基础与借鉴，以期为生产应用提供必要的实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 从云杉中提取的半乳糖葡萄甘露聚糖（纯度95.8%）。
1.1.2 主要仪器与设备（表1）
1.2 方法
1.2.1 红外光谱分析 红外光谱仪是分析多糖结构有力的工具，可帮助识别吡喃糖和呋喃糖，帮助确定糖苷键类型、糖的构型以及多糖链上羟基的取代情况等信息。本实验采用Vector 33傅里叶变换红外光谱仪对GGM分子链结构进行表征，具体操作如下：将少量的GGM固体粉末加入到KBr粉末中，碾碎并搅拌均匀，用压片机将样品压成薄片，将压好的样品薄片放置在傅立叶变换红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，扫描的波长范围为400～4 000 cm，测试前需要扣除背景谱图。
1.2.2 核磁共振分析 将GGM样品溶于重水（D2O）中，5 mm样品管，测定温度为室温，在Bruker AVANCE Ⅲ 500仪器上测其波谱。500 MHZ NMR测氢谱，125 MHZ NMR测碳谱。
1.2.3 原子力显微镜观察分析 称1 mg样品溶于1 mL纯水中，稀释至样品浓度1×10-2 mg/L。采用5 500原子力显微镜测定GGM分子链三维形态与结构。样品尺寸≤10 mm，TM振动模式，针尖为225 ym长Si（弹性常数为20～70 N/m），A型扫描头，分辨率（以云母表面晶格为准）XY方向<0.4 nm，Z方向<0.1 nm，针尖逼近行程≥20 mm，精度≤0.1衸，图像均在Tapping模式下获得；接触作用力控制在3～4 nN量级以内，所在实验均在大气、常温（20 ℃）和相对湿度30%下完成。 1.2.4 扫描电镜测试 取少量GGM样品均匀分散于带双面胶的样品铜台上，然后进行喷金处理。测定条件：放大倍率：500～10 000倍；最大加速电压：15 kV。扫描时将带有样品的铜台置于扫描电镜中，观察颗粒表面形貌，选择适宜的观察倍数，挑取分离的、具有代表性的样品进行拍摄。
2 结果与分析
2.1 FT-IR图谱分析
红外光谱在4 000～400 cm区间进行扫描（图1），即为GGM的特征吸收峰：3 435.97 cm处出现的宽峰是O-H伸缩振动峰，表明GGM存在分子间和分子内氢键，分子主链上含有丰富的-OH；2 927.33 cm处出现的吸收峰是GGM-CH2-的C-H伸缩振动引起的；1 735.58 cm处出现的吸收峰是C=O伸缩振动引起的（极可能为醛基），1 636.50 cm处出现的吸收峰是半缩醛的C=O伸缩振动引起的；1 420.18 cm处吸收峰是=CH2变形振动引起的，1 383.51 cm处吸收峰是C-H弯曲振动引起的，1 254.73 cm处吸收峰是O-H弯曲振动引起的，这些峰是糖类的特征吸收峰；1 064.94 cm和1 030.35 cm处吸收峰是醇羟基（CH-OH）的C-O伸缩振动引起的；895.70 cm处吸收峰是环氧（C-O-C）伸缩振动和对称振动引起的，874.21 cm处存在β-型糖苷键的特征吸收峰。
2.2 核磁共振分析
核磁共振结果如图2所示，1H-HMR谱图中，多糖的异头氢信号大多数集中在δ 4.0～5.5 ppm狭小的范围内，一般α构型糖苷的异头氢的共振比β构型糖苷向低场位移0.3～0.5 ppm，一般地α构型糖苷大于δ 5.0 ppm，β构型糖苷小于δ 5.0 ppm。GGM的1H-HMR谱（图2-a）显示，C1的质子信号在δ 4.4、5.4 ppm，这说明GGM的糖苷键存在α构型和β构型。
从GGD的13C-NMR谱（图2-b）中分析，异头碳信号集中在δ 60～80 ppm和δ 100～110 ppm，说明结构为β-（1→4）-D-吡喃式葡萄糖基和β-D-吡喃式甘露糖基以1，4甙键连接成主链，α-D-吡喃半乳糖基作为侧链通过1，6甙键连接到主链上。
2.3 原子力显微镜观察分析
GGM的原子力显微镜照片如图3所示，多糖大分子链呈现出多分枝的结构。糖链的密集度依赖于其初始浓度及其沉积到云母表面的量；图像的对比度依赖于针尖上的作用力，作用力太大易损坏糖链，太小则对比度差，很难得到清晰、稳定的图像，最佳的作用力大概在3～4 nN。
图3-a和3-b是GGM在云母片上的AFM图像，扫描范围分别为50 μm×50 μm，从图可以清楚地观察到GGM分子的单分子形貌。单糖分子为链状，但链状分子并非直线形，而是发生螺旋、折叠、卷绕、分支。单个的多糖分子链中存在侧枝，多个分子链间互相缠绕，链间通过糖单元间不同的连接方式衍生许多环或带有分支的侧链结构，说明GGM具有高度分枝的化学结构。单链的厚度小于2.8 nm，长度为50 nm～2 μm，宽度为10～40 nm，一般多糖的分子链大小为0.1～1.0 nm，本研究得到的图像宽度远大于单链分子的估计值，原因可能是由于针尖在扫描时与分子间相互作用导致增宽效应，以及由于糖链间范德瓦尔斯力相互作用及糖链与带负电的云母表面产生相互作用，使得多糖链分子聚集平铺在云母表面。
图3-c和3-d是GGM分子的高分辨图像，从图中可明显观察到单个的分子链及其侧枝结构，以及分子内的缠绕和螺旋状结构，螺圈相互连接成链，这些螺旋结构的左旋和右旋，可能和多糖的L型与D型有关。
2.4 扫描电镜分析
GGM的扫描电子显微镜照片如图4所示，图a～e分别放大500、1 000、2 000、5 000和10 000倍。从不断放大的图片可以较为清楚的看到GGM的形貌，500倍时外表呈现出杂乱絮状团簇状，随着倍数增加团簇状可看出一堆小球状，单个小球状的直径为1～2 μm，图d可模糊看出小球状外表有绒毛，图e放大到10 000倍清晰的看到小球状外表有线状绒毛。
3 结论
多糖的结构是其生物活性的基础，结构分析在多糖的研究中具有非常重要的地位，是糖化学的核心。研究GGM分子链的结构和表面特征，对其功能特性研究具有重要的意义。基于此，本文借助现代仪器分析技术对GGM分子结构特性进行了表征。主要结论如下：
（1）红外光谱分析结果显示，GGM分子链在3 352、2 930、1 639、1 354、1 230、1 028 cm出现特征吸收峰。
（2）经NMR鉴定GGM分子链结构存在α构型和β构型糖苷键；β-（1→4）-D-吡喃式葡萄糖基和β-D-吡喃式甘露糖基以1，4甙键连接成主链，α-D-吡喃半乳糖基作为侧链通过1，6甙键连接到主链上。
（3）经NMR鉴定GGM单糖分子为链状，但链状分子并非直线形，而是发生螺旋、折叠、卷绕、分支。单个的多糖分子链中存在侧枝，多个分子链间互相缠绕，链间通过糖单元间不同的连接方式衍生许多环或带有分支的侧链结构，具有高度分枝的化学结构。单链的厚度小于2.8 nm，长度为50 nm～2 μm，宽度为10～40 nm。
（4）扫描电子显微镜对样品进行扫描分析放大倍数从500倍10 000倍。从不断放大的图片可以较为清楚的看到GGM的形貌，呈团簇状，小球状外表有线状绒毛。
参考文献
[1] 方来毅. 杉木优良品系无性繁殖技术[J]. 林业科技开发， 2005， 19（6）： 79-80.
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[5] 张 曼， 刘进鹏， 刘 娟， 等. 不同产地杉木枝叶中穗花杉双黄酮的含量测定[J]. 药学服务与研究， 2011， 11（2）： 149-150.
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[9] 何曼君， 喻勤健， 裘月侣. 用粘度法测定半乳甘露聚糖的分子量和分子链构型参数[J]. 高分子材料科学与工程， 1988， （3）： 21-28.
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[13] Filip S E， Ana Ardá， Patrik Eklund， et al. Studies Related to Norway Spruce Galactoglucomannans： Chemical Synthesis， Conformation Analysis， NMR Spectroscopic Characterization， and Molecular Recognition of Model Compounds[J]. Chemistry-A European Journal， 2012， 18（45）： 14 392-14 405.
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关键词 云杉半乳葡甘露聚糖；结构表征；仪器分析
中图分类号 S831.5 文献标识码 A
Abstract The molecule structure and surface characteristic of galactoglucomannan（GGM）in spruce were studied with instrumental analysis. The characteristic absorbance peaks were revealed at 3 352 cm、2 930 cm、1 639 cm、1 354 cm、1 230 cm、1 028 cm in the FT-IR spectrum The main chain of GGM is composed of 1，4 glycosidic bond， which were proved as β-（1→4）-D-glucopyranose and mannopyranose. The galactopyranose was the side chain， which was connected to the main chain by 1，6 glycosidic bond. The chain of GGM was not shown as linear but spiral， folding， winding and branch. The multiple branch structure of GGM was composed by variety of saccharide unit， bond and branch. The length and width were range from 50-2 μm and 10-40 nm， the thickness was less than 2.8 nm. The appearance of GGM was like cluster， as the linear velvet on the globe surface.
Key words GGM； Structural characterization； Instrumental analysis
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.017
杉木是我国重要的用材树种，具有生长快、产量高、材质好、用途广和易繁殖等特点[1-3]。目前，研究和开发较多的是杉木树根、树皮、树叶和木材的抽提物，如杉木根精油、杉木叶黄酮类化合物等[4-5]，研究表明，杉木抽提物的功能奇特，广泛应用于各行各业，如紫杉醇用于治疗癌症等[6-7]。
但杉木中还含有其他多种功能成分，如多糖、游离氨基酸、甾体类化合物、脂肪酸和维生素等，其中半纤维素多糖占20%～25%，而半纤维素多糖中含量最高的就是半乳葡甘露聚糖（galactoglucomannan，GGM），约占20%[8]，由β-D-吡喃式葡萄糖基和β-D-吡喃式甘露糖基以1，4甙键连接成主链，α-D-吡喃半乳糖基作为侧链通过1，6甙键连接到主链上。GGM中含有大量的羟基，形成分子间或分子内氢键，使GGM具有一定的流变性、持水性、胶凝性、成模性等特性[9-12]，然而关于GGM分子结构和表面特征的结论至今尚未统一，这是限制其应用的主要因素。目前，国内对云杉GGM的研究较少，无相关的文献报道，国外有部分学者在对云杉GGM进行研究，但主要集中在云杉GGM的理化性质方面，对结构和表面特征研究较少[9-12]。基于此，本研究拟采用红外光谱、核磁共振、原子力显微镜、扫描电子显微镜等近现代先进技术研究GGM的结构和表面特征，为其改性提供理论基础与借鉴，以期为生产应用提供必要的实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料 从云杉中提取的半乳糖葡萄甘露聚糖（纯度95.8%）。
1.1.2 主要仪器与设备（表1）
1.2 方法
1.2.1 红外光谱分析 红外光谱仪是分析多糖结构有力的工具，可帮助识别吡喃糖和呋喃糖，帮助确定糖苷键类型、糖的构型以及多糖链上羟基的取代情况等信息。本实验采用Vector 33傅里叶变换红外光谱仪对GGM分子链结构进行表征，具体操作如下：将少量的GGM固体粉末加入到KBr粉末中，碾碎并搅拌均匀，用压片机将样品压成薄片，将压好的样品薄片放置在傅立叶变换红外光谱仪中，测定样品的红外吸收光谱，扫描的波长范围为400～4 000 cm，测试前需要扣除背景谱图。
1.2.2 核磁共振分析 将GGM样品溶于重水（D2O）中，5 mm样品管，测定温度为室温，在Bruker AVANCE Ⅲ 500仪器上测其波谱。500 MHZ NMR测氢谱，125 MHZ NMR测碳谱。
1.2.3 原子力显微镜观察分析 称1 mg样品溶于1 mL纯水中，稀释至样品浓度1×10-2 mg/L。采用5 500原子力显微镜测定GGM分子链三维形态与结构。样品尺寸≤10 mm，TM振动模式，针尖为225 ym长Si（弹性常数为20～70 N/m），A型扫描头，分辨率（以云母表面晶格为准）XY方向<0.4 nm，Z方向<0.1 nm，针尖逼近行程≥20 mm，精度≤0.1衸，图像均在Tapping模式下获得；接触作用力控制在3～4 nN量级以内，所在实验均在大气、常温（20 ℃）和相对湿度30%下完成。 1.2.4 扫描电镜测试 取少量GGM样品均匀分散于带双面胶的样品铜台上，然后进行喷金处理。测定条件：放大倍率：500～10 000倍；最大加速电压：15 kV。扫描时将带有样品的铜台置于扫描电镜中，观察颗粒表面形貌，选择适宜的观察倍数，挑取分离的、具有代表性的样品进行拍摄。
2 结果与分析
2.1 FT-IR图谱分析
红外光谱在4 000～400 cm区间进行扫描（图1），即为GGM的特征吸收峰：3 435.97 cm处出现的宽峰是O-H伸缩振动峰，表明GGM存在分子间和分子内氢键，分子主链上含有丰富的-OH；2 927.33 cm处出现的吸收峰是GGM-CH2-的C-H伸缩振动引起的；1 735.58 cm处出现的吸收峰是C=O伸缩振动引起的（极可能为醛基），1 636.50 cm处出现的吸收峰是半缩醛的C=O伸缩振动引起的；1 420.18 cm处吸收峰是=CH2变形振动引起的，1 383.51 cm处吸收峰是C-H弯曲振动引起的，1 254.73 cm处吸收峰是O-H弯曲振动引起的，这些峰是糖类的特征吸收峰；1 064.94 cm和1 030.35 cm处吸收峰是醇羟基（CH-OH）的C-O伸缩振动引起的；895.70 cm处吸收峰是环氧（C-O-C）伸缩振动和对称振动引起的，874.21 cm处存在β-型糖苷键的特征吸收峰。
2.2 核磁共振分析
核磁共振结果如图2所示，1H-HMR谱图中，多糖的异头氢信号大多数集中在δ 4.0～5.5 ppm狭小的范围内，一般α构型糖苷的异头氢的共振比β构型糖苷向低场位移0.3～0.5 ppm，一般地α构型糖苷大于δ 5.0 ppm，β构型糖苷小于δ 5.0 ppm。GGM的1H-HMR谱（图2-a）显示，C1的质子信号在δ 4.4、5.4 ppm，这说明GGM的糖苷键存在α构型和β构型。
从GGD的13C-NMR谱（图2-b）中分析，异头碳信号集中在δ 60～80 ppm和δ 100～110 ppm，说明结构为β-（1→4）-D-吡喃式葡萄糖基和β-D-吡喃式甘露糖基以1，4甙键连接成主链，α-D-吡喃半乳糖基作为侧链通过1，6甙键连接到主链上。
2.3 原子力显微镜观察分析
GGM的原子力显微镜照片如图3所示，多糖大分子链呈现出多分枝的结构。糖链的密集度依赖于其初始浓度及其沉积到云母表面的量；图像的对比度依赖于针尖上的作用力，作用力太大易损坏糖链，太小则对比度差，很难得到清晰、稳定的图像，最佳的作用力大概在3～4 nN。
图3-a和3-b是GGM在云母片上的AFM图像，扫描范围分别为50 μm×50 μm，从图可以清楚地观察到GGM分子的单分子形貌。单糖分子为链状，但链状分子并非直线形，而是发生螺旋、折叠、卷绕、分支。单个的多糖分子链中存在侧枝，多个分子链间互相缠绕，链间通过糖单元间不同的连接方式衍生许多环或带有分支的侧链结构，说明GGM具有高度分枝的化学结构。单链的厚度小于2.8 nm，长度为50 nm～2 μm，宽度为10～40 nm，一般多糖的分子链大小为0.1～1.0 nm，本研究得到的图像宽度远大于单链分子的估计值，原因可能是由于针尖在扫描时与分子间相互作用导致增宽效应，以及由于糖链间范德瓦尔斯力相互作用及糖链与带负电的云母表面产生相互作用，使得多糖链分子聚集平铺在云母表面。
图3-c和3-d是GGM分子的高分辨图像，从图中可明显观察到单个的分子链及其侧枝结构，以及分子内的缠绕和螺旋状结构，螺圈相互连接成链，这些螺旋结构的左旋和右旋，可能和多糖的L型与D型有关。
2.4 扫描电镜分析
GGM的扫描电子显微镜照片如图4所示，图a～e分别放大500、1 000、2 000、5 000和10 000倍。从不断放大的图片可以较为清楚的看到GGM的形貌，500倍时外表呈现出杂乱絮状团簇状，随着倍数增加团簇状可看出一堆小球状，单个小球状的直径为1～2 μm，图d可模糊看出小球状外表有绒毛，图e放大到10 000倍清晰的看到小球状外表有线状绒毛。
3 结论
多糖的结构是其生物活性的基础，结构分析在多糖的研究中具有非常重要的地位，是糖化学的核心。研究GGM分子链的结构和表面特征，对其功能特性研究具有重要的意义。基于此，本文借助现代仪器分析技术对GGM分子结构特性进行了表征。主要结论如下：
（1）红外光谱分析结果显示，GGM分子链在3 352、2 930、1 639、1 354、1 230、1 028 cm出现特征吸收峰。
（2）经NMR鉴定GGM分子链结构存在α构型和β构型糖苷键；β-（1→4）-D-吡喃式葡萄糖基和β-D-吡喃式甘露糖基以1，4甙键连接成主链，α-D-吡喃半乳糖基作为侧链通过1，6甙键连接到主链上。
（3）经NMR鉴定GGM单糖分子为链状，但链状分子并非直线形，而是发生螺旋、折叠、卷绕、分支。单个的多糖分子链中存在侧枝，多个分子链间互相缠绕，链间通过糖单元间不同的连接方式衍生许多环或带有分支的侧链结构，具有高度分枝的化学结构。单链的厚度小于2.8 nm，长度为50 nm～2 μm，宽度为10～40 nm。
（4）扫描电子显微镜对样品进行扫描分析放大倍数从500倍10 000倍。从不断放大的图片可以较为清楚的看到GGM的形貌，呈团簇状，小球状外表有线状绒毛。
参考文献
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